田晨霞,張詠梅，馬暉玲

(1.甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070； 2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 4.甘肅農業(yè)大學研究測試中心，甘肅 蘭州 730070)

采用石蠟切片技術了解植物胚胎發(fā)育過程已經成為研究植物生殖現象的重要手段之一。石蠟切片是觀察植物組織結構常用的技術之一，在研究植物形態(tài)建成、植物雜交育種、特殊植物的培育和鑒別等方面應用較多[1-2]。草地早熟禾(Poapratensis)為禾本科早熟禾屬多年生草本植物，具有兼性無融合生殖的特性[3]。借助石蠟切片技術，可對草地早熟禾胚胎的顯微結構及其發(fā)育過程進行研究，從而確定各種草地早熟禾品種及野生材料的生殖方式及無融合生殖比率，也可為早熟禾屬種質的雜交親本選擇、雜交優(yōu)勢預測及新品種選育提供理論依據。

在石蠟切片技術中，確定和優(yōu)化影響切片質量的各關鍵因素，是保證供試材料細胞學和胚胎學研究順利實施的關鍵和基礎。石蠟切片的制作包括樣品的采集、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、貼片、烘片、脫蠟、染色和封片等一系列過程[4]。不同的植物材料或同一植物的不同組織、器官，其材料的固定、透明、浸蠟、展片、烤片及染色等過程均存在顯著差異。前人已對不同材料不同組織的切片方法進行了大量改進。蘇印泉等[4]在傳統(tǒng)石蠟切片法的基礎上，對固定、軟化、包埋及染色等步驟進行了適合松蘿屬植物特點的改良，制得了組織完整、染色清晰的松蘿切片。何承坤等[5]利用番紅-固綠兩種染液對植物石蠟切片進行一步雙重整體染色，這兩種染料能一次性地進行雙重染色，因組織不同著色不同，紅綠鮮明，分色效果良好。由于植物的生殖生長階段是植物生長的重要階段，觀察花器官的顯微結構也是了解植物生殖過程常用的手段之一，因此，如何通過石蠟切片觀察植物生殖過程成為人們關注的焦點。為了觀察板栗(Castaneamollissima)雄花序的解剖結構，韓寶等[6]采用改良的切片技術將制片時間縮短為原來周期的1/3，并獲得質量同常規(guī)方法無區(qū)別的切片。于小剛等[7]以粳稻(Oryzasativasubspkeng)開花后不同天數的穎果為試材，對傳統(tǒng)石蠟切片技術中固綠染色時間進行試驗，發(fā)現不同時期的材料所需固綠染色時間不同。趙桂琴和曹致中[8]應用胚囊整體染色透明法，對不同品種和來源的草地早熟禾無融合生殖進行了研究。楊弘遠[9]、李和平等[10]用胚囊整體透明法結合切片法對草地早熟禾胚胎發(fā)育進行了研究，取得了很好的效果。

由于草地早熟禾花極小且穎片和稃角質化，浸蠟比較困難，切片易碎，草地早熟禾胚胎發(fā)育的石蠟切片技術方面的研究報道相對較少。近年來，國內外在利用石蠟切片技術觀察糧食作物和油料樹木[11]胚胎發(fā)育方面的研究相對較多，而草地早熟禾生殖現象的觀察多借鑒高粱(Sorghumvulgare)[12-13]和水稻[14-15]的石蠟制片方法。但因材料大小存在差異，利用糧食作物石蠟切片法觀察草地早熟禾的胚胎發(fā)育過程存在一定困難。目前，子房整體透明法，因其程序相對簡單、制片周期短、成功率高，成為草地早熟禾胚胎發(fā)育的首選研究方法，但在觀察胚胎過程中，受胚珠外子房壁的影響，不能直接清晰地觀察到細胞層面。石蠟切片技術是觀察植物解剖結構的重要方法之一，草地早熟禾胚胎制片過程中采用常規(guī)石蠟切片法成功率低，但如果將石蠟切片技術加以改良，提高其成功率，這一技術將在觀察胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。本研究以草地早熟禾胚胎為供試材料，對影響其石蠟切片質量的各關鍵因素進行優(yōu)化，探討石蠟切片制作過程中需要注意的各項技術環(huán)節(jié)的不足和改良措施，分析比較切片制作中經不同染色劑及染色時間處理所產生的效果，以期獲取優(yōu)質的草地早熟禾胚胎結構石蠟切片，為進一步開展草地早熟禾生殖特性研究提供理論數據。

1 材料與方法

1.1試驗材料 選取無病斑、無蟲害且生長狀況良好的開花期草地早熟禾小穗軸。

1.2樣品采集與固定 采集新鮮材料固定于70%乙醇濃度的FAA混合固定液(福爾馬林∶冰醋酸∶70%乙醇=1∶1∶18)中。真空抽氣 15～20 min，保證藥品充分浸泡材料以迅速殺死細胞，防止細胞自溶，保存完整的細胞結構。24 h后轉入70%乙醇中進行脫水處理或保存。

將材料置于70%乙醇中放在顯微鏡下用解剖刀和解剖針去掉早熟禾小花的內穎和外穎，并將每朵小花分離。

1.3脫水 采用酒精梯度濃度法脫水。脫水程序：70%(2 h)→85%(2 h)→95%(2 h)→100%(1 h)→100%(1 h)，在脫水過程中將95%的酒精換為以95%酒精作溶劑的伊紅溶液[1]，搖床搖動脫水。

1.4透明 本研究采用的透明劑為二甲苯(Xylene)，透明步驟在通風櫥中進行。為防止材料發(fā)生收縮，采取逐級過渡的方法，即逐步從無水乙醇過渡到純二甲苯中。該步驟為2/3無水乙醇+1/3二甲苯→1/2無水乙醇+1/2二甲苯→1/3無水乙醇+2/3二甲苯→二甲苯I→二甲苯II。純二甲苯更換兩次，以除盡乙醇。

1.5浸蠟與包埋 選用熔點為52～56 ℃的石蠟浸蠟，各級浸蠟時間及溫度如表1所示。包埋前事先備好冰袋，將蠟液倒入包埋盒中并平置于冰袋上降溫，待底層蠟液稍有凝固后迅速將材料移入包埋盒中，立刻置于冷水中待其凝固。

1.6修塊及固定 取出包含有材料及蠟塊的小紙盒，除去包被蠟塊周圍的紙，露出包含有材料的蠟塊。依據材料所處位置，將蠟塊切割并修成下寬上窄的梯形，使每個小塊包含一個材料，注意上部矩形對邊平行。滴幾滴融化的蠟于小木塊上，將梯形蠟塊底部粘貼其上，使其粘貼牢固。

1.7切片、展片、烤片 切片前事先在展片臺盛滿蒸餾水，水溫調至40 ℃，然后將切成的蠟帶漂在水面中(亮面朝下)，待蠟帶平整后用干凈的載玻片一端浸入展片臺中并將蠟帶輕輕移到載玻片上整齊排列，貼上標簽放置在烤片臺上，烤片臺調至38 ℃，待載玻片上水珠蒸發(fā)后放在烘箱37 °C中烤片72 h，進行脫蠟染色。

1.8染色與封固

1.8.1番紅-固綠雙重染色法 染色中番紅以水配制，固綠用95%乙醇配制。番紅-固綠對染具體步驟為：脫蠟結束→100%乙醇(3 min)→95%乙醇(2 min)→83%乙醇(2 min)→70%乙醇(2 min)→50%乙醇(2 min)→35%乙醇(2 min)→番紅染液(質量分數1%，1～12 h)→35%乙醇(2 min)→50%乙醇(2 min)→70%乙醇(2 min)→83%乙醇(2 min)→固綠染液(0.5%濃度，5～10 s)→95%乙醇(2 min)→100%乙醇(1 min)→2步透明(5～10 min)→封片→自然風干。

表1 各級蠟所需溫度及浸蠟時間Table 1 Paraffin required temperature and time of each level

番紅-固綠雙重染色時采用4種染色組合：番紅2 h+固綠5 s、番紅3 h+固綠5 s、番紅4 h+固綠5 s和番紅4 h+固綠10 s。

1.8.2埃利希氏(Ehrlich’s)蘇木精-伊紅染色(H.E.)雙染 埃利希氏蘇木精的配制：蘇木精1 g，純酒精(或95%酒精)50 mL，冰醋酸5 mL，甘油50 mL，鉀礬(硫酸鋁鉀)5 g，蒸餾水50 mL，瓶口用雙層紗布包扎，放于通風處，直至變?yōu)樽霞t時即可使用。用前將原液一份加50%酒精與冰醋酸等量混合液稀釋。

伊紅用95%乙醇配制：材料前處理階段進行脫水處理時將95%的酒精換為以95%酒精作溶劑的伊紅溶液[1]。脫蠟后進行“復水”，染色，具體步驟為：脫蠟結束后→100%乙醇(3 min)→95%乙醇(2 min)→83%乙醇(2 min)→70%乙醇(2 min)→50%乙醇(2 min)→35%乙醇(2 min)→蒸餾水(2 min)→4%鐵礬(10 min)→流水沖洗(10 min)→蒸餾水過一下→埃利希氏蘇木精(0.5%濃度，10～30 min)→自來水返藍(10～30 min)→2%鐵礬(8 s)→自來水(10 min)→35%乙醇(2 min)→50%乙醇(2 min)→70%乙醇(2 min)→83%乙醇(2 min)→伊紅(0.5%濃度，5 min)→100%乙醇(2 min)→兩步透明(5～10 min)→封片→自然風干。

埃利希氏蘇木精-伊紅雙重染色中采用3種染色組合：蘇木精10 min-伊紅10 min+自來水返藍10 min、蘇木精20 min-伊紅20 min+自來水返藍20 min和蘇木精30 min-伊紅10 min+自來水返藍30 min。

2 結果與討論

2.1材料處理對石蠟切片質量的影響 草地早熟禾為圓錐狀花序，每個小穗有內、外穎，均由3～4朵小花組成，每朵小花的體積不足2 mm3，每朵小花由內、外稃包被，穎片和稃均角質化。在切片制作過程中，這樣的結構使得藥品不易通過角質化的穎片和稃片透入材料內部，造成材料質量不均一，后期切片易破裂，很難觀察到完整的子房結構和胚胎的發(fā)育過程。若剝除內外稃片，則因草地早熟禾內、外稃包被緊密，剝除過程大量子房破裂，損傷材料，從而影響觀察結果。草地早熟禾的子房極小，在后期換藥及包埋過程中給試驗的操作造成了極大的困難。對于脫水過程中將95%的酒精換為伊紅溶液(95%酒精作溶劑)，在染色前觀察到草地早熟禾小花的稃片往往被染為淺紅色，子房幾乎未被染色，而在后期的透明、浸蠟及包埋過程易于觀察材料，且對后期染色過程亦無影響，故在材料選取中保留稃片。

2.2樣品脫水程序的改良及效果分析 因草地早熟禾的小穗外有穎片，每朵小花外有稃片，穎片和稃片表皮角質化致使脫水劑透過組織受阻，可采用搖床搖動脫水[16]。增加脫水劑與材料表面的接觸機會，從而提高脫水效率并縮短脫水時間。直接采用無水乙醇脫水必會導致材料組織硬化，應采用梯度濃度法脫水。脫水過程中嚴格控制脫水時間，不宜過長，起始脫水劑濃度也不宜過高，否則組織會變硬變脆。本研究采用常規(guī)的石蠟脫水程序，即70%酒精(2 h)→85%酒精(2 h)→0.5%伊紅溶液(95%酒精為溶劑,2 h)→100%酒精(1 h)→100%酒精(1 h)。

與常規(guī)石蠟切片法相比，將95%的酒精換為0.5%的伊紅溶液(95%酒精作溶劑)，可在后期透明、浸蠟、包埋、切片過程中避免因草地早熟禾穎花小而不易觀察，材料因無色透明而造成丟失。在染色過程中由于再次用到伊紅而不影響染色，可在應用過程中獲得較好的效果。

2.3浸蠟與包埋方法改良及效果分析 浸蠟是通過包埋劑代替透明劑且滲入整個組織，來支撐整個組織并穩(wěn)定其結構的過程[16]。草地早熟禾稃片角質化而造成浸蠟困難，在浸蠟過程中需要有多個梯度，一點一點加入碎蠟，通過二甲苯這一介質使蠟進入子房中。浸蠟溫度過高會引起組織收縮，造成切片中材料變形；過低則使石蠟不能完全熔化，難以均勻地滲透到組織內部且組織材料中易混有氣泡，切片過程中易發(fā)生斷片、掉片或切片呈空洞蠟帶。本研究選用熔點為52～56 ℃的石蠟浸蠟。按照常規(guī)包埋程序因石蠟凝固慢，造成一些嫩小材料的包埋困難[17]。針對此問題，在包埋前事先備好冰袋平置于臺面，放入包埋材料后將蠟液平置于冰袋上降溫，待底層蠟液稍有凝固后迅速將材料移入盛有冷水的包埋盒中凝固。此法可使材料穩(wěn)定性提高，易于掌握。

2.4切片、展片和烤片及方法的改良和效果分析 切片成敗不僅與切片前一系列處理有關，而且與切片過程中的操作密切相關[18]。切片時用力應均勻一致，不宜過重過猛，否則容易造成切片厚薄不均且蠟帶卷曲。常規(guī)貼片是將蠟帶放到貼片板上，石蠟切片法中傳統(tǒng)的貼片方法主要為燙片臺法，即在一定的溫度下進行攤片、用甘油蛋清粘片。這種貼片方法速度慢，操作時還易出現蠟帶中間有皺褶、組織材料不能完全展開的現象；且過程煩瑣，貼出的片子在脫蠟過程中，蛋清甘油不易脫落，造成切片染色后蛋清甘油染色，使切片背景模糊，影響材料的后期觀察。本研究采用改良的方法，即在切片前在展片臺盛滿蒸餾水，調節(jié)水溫至40 ℃，然后將切成的蠟帶漂在水面中，亮面朝下，待蠟帶平整后，用干凈的載玻片一端浸入展片臺中將蠟帶輕輕移到載玻片上，整齊排列，貼上標簽放置在烤片臺上烤片。采取此方法貼片速度快，展片效果良好，且一次可獲得較長蠟帶，可以從中選擇最理想的材料，選擇余地大，對于連續(xù)或不連續(xù)切片都適宜。

在石蠟切片制作過程中，因粘片劑的有無，植物組織大小的不同，所需烤片時間也不同。將剛從溫水中撈出的切片放在38 ℃烤片臺烤片，待載玻片上水珠蒸發(fā)后放置37 °C烘箱中烤片72 h進行染色。采用此改良方法，可使蠟帶不起皺、硬度適中且不粘連，確保材料組織的完整性，且樣品染色背景干凈清晰。在本試驗過程中因材料小，未使用粘片劑，烤片時間需不少于72 h才能保證在染色過程中不會脫片。

2.5各種處理的染色效果對比

2.5.1番紅-固綠雙重染色效果 采用番紅-固綠雙重染色，在不同染色時間組合下均未取得良好的效果。在染色過程中番紅染色2 h，固綠染色5 s時，細胞核染色清晰，細胞壁亦明顯，番紅-固綠分色效果不明顯，胚胎處細胞集中區(qū)染色較深，細胞核顏色發(fā)藍，細胞壁綠色較淡；番紅染色3 h，固綠染色5 s時，細胞核染色清晰為紫色，細胞壁染色不明顯，部分區(qū)域番紅染色集中，番紅-固綠分色不明顯，胚胎處細胞集中區(qū)染色較深；番紅染色4 h，固綠染色5 s時，細胞核染色較深為紫色，細胞壁不明顯，部分區(qū)域番紅染色集中，番紅-固綠分色不明顯，胚胎處細胞集中區(qū)染色太深；番紅染色4 h，固綠染色10 s時，整個材料染色過深，胚胎部位細胞染色極深，細胞邊緣不明顯，無分色效果(表2、圖1)。

2.5.2埃利希氏蘇木精-伊紅染色效果 采用3種染色處理，經蘇木精-伊紅雙重染色后，細胞核著藍紫色，其余部分為淡紅色。 本研究表明，不同染色劑和染色時間處理下所表現出的染色效果均不同。埃利希氏蘇木精-伊紅染色過程中，蘇木精染色10 min，伊紅染色10 min，自來水返藍10 min，胚胎處細胞核淺紅色，細胞壁染色淺，細胞邊緣不明顯；蘇木精染色20 min，伊紅染色10 min，自來水返藍20 min，胚胎處細胞核粉紅色，細胞壁染色較淺，細胞間邊緣明顯；蘇木精染色30 min，伊紅染色10 min，自來水返藍30 min，胚胎處細胞核紫色，細胞壁粉色，深淺分明，不同部位顏色不同，染色效果較好。相比較，蘇木精染色30 min，伊紅染色10 min，自來水返藍30 min的處理下顯示出良好的效果(表3、圖2)。

表2 番紅-固綠不同染色時間處理下的效果比較Table 2 Comparison of dying effects with different Sarranine-Fast green dying times

圖1 番紅-固綠不同染色時間下的染色效果圖Fig.1 Comparison of dying effects with different Sarranine-Fast green dying times

2.5.3草地早熟禾胚胎石蠟切片過程中染色劑的選擇及染色效果 植物組織制片過程應根據觀察目的、樣品的結構來選擇適當的染色方法。植物制片中使用的染料種類較多，根據染色時所用染料的種類可分為單染、雙重染色及多重染色。在石蠟切片制片過程中一般采用雙重染色法，番紅-固綠染色法和蘇木精-伊紅是雙重染色法中最常用的兩種染色方法。

表3 蘇木精-伊紅及染色時間處理下的效果比較Table 3 Comparison of dying effects with different Ehrlich’s hematoxylin-eosin dying times

圖2 埃氏蘇木精-伊紅對染中不同染色時間及返藍時間的染色效果圖Fig.2 Comparison of dying effects with different Ehrlich’s hematoxylin-eosin dying times

番紅-固綠對染法適用材料為一般植物組織，特別是分生組織。其染色目的是將染色質、細胞質、纖維素細胞壁與木質化細胞壁區(qū)別開[1]。草地早熟禾子房小，胚珠細胞小而集中，細胞核占據整個細胞的大部分位置，細胞質少。對草地早熟禾胚胎石蠟切片采用番紅-固綠對染法染色后存在細胞界線不清，核仁不清晰等缺點，相比之下，蘇木精-伊紅染色法的目的是將細胞核、細胞質區(qū)別開，染色過程中經本試驗確定的時間染色后，草地早熟禾胚胎處色彩艷麗，核膜、核仁清晰，細胞界線明顯。

本研究采用埃利希氏蘇木精-伊紅雙重染色的3種染色組合：即蘇木精10 min-伊紅10 min+自來水返藍10 min、蘇木精20 min-伊紅10 min+自來水返藍20 min和蘇木精-伊紅10 min+自來水返藍30 min，此過程中只有蘇木精染色和自來水返藍時間變化，伊紅染色時間為10 min不變。結果表明，蘇木精30 min-伊紅10 min、自來水返藍30 min的處理下細胞核部分染色較深，細胞壁部分顏色淺，細胞邊緣清楚，能較好地觀察胚胎發(fā)育過程。

3 結論

草地早熟禾胚胎石蠟切片過程并不復雜，但每一個操作步驟都至關重要，要制作出高質量的石蠟切片，必須對制作石蠟切片過程中的每一環(huán)節(jié)予以重視。本研究通過對石蠟制片中的一些步驟進行改進，得出蘇木精30 min-伊紅染色10 min、自來水返藍30 min處理下的細胞核部分染色較深，細胞壁部分顏色淺，細胞邊緣清楚，能較好觀察胚胎發(fā)育過程。

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