高 陽,楊獻(xiàn)玲,徐多多

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心,長春 130117;2.吉林省食品藥品檢驗(yàn)所,長春 130021)

安絡(luò)小皮傘(Marasmius and rosaceus)俗稱鬼毛針，是一種真菌，屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、白蘑科小皮傘屬。也是一種用于治療多種疼痛的中藥,商品名稱為安絡(luò)痛。研究[1-3]表明，其鎮(zhèn)痛作用為有機(jī)酸和甾醇類化合物[1-3]。筆者對其有效部位進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)其水提醇沉淀物具有長時效鎮(zhèn)痛作用，并對該有效部位進(jìn)行分離、純化，通過甲基化等方法，研究其理化性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)，確定其鎮(zhèn)痛作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為安絡(luò)小皮傘菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 安絡(luò)小皮傘菌絲體發(fā)酵物由吉林省新華藥業(yè)提供。DEAE-Sephadex A-50，Sephadex G-100，標(biāo)準(zhǔn)單糖Fuc(巖藻糖)、Rha(鼠李糖)、Ara(阿拉伯糖)、Xyl(木糖)、Man(甘露糖)、Gal(半乳糖)、Glu(葡萄糖)、葡萄糖醛酸(GlcA)、牛血清蛋白均為Sigma公司產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。蛋白質(zhì)測定用試劑甲、乙為本實(shí)驗(yàn)室配制。大孔吸附樹脂D101為天津大學(xué)生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 安絡(luò)小皮傘菌絲體發(fā)酵物加5倍量水溶解，離心，重復(fù)此操作4次,殘?jiān)稍?R)，上清液合并，濃縮至小體積，加95%乙醇至醇濃度達(dá)到80%，靜止過夜，離心,沉淀冷凍干燥(樣品P)，上清液回收乙醇，得到醇溶性小分子部分(S)。

1.2.2 理化性質(zhì)的分析 樣品總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸含量測定分別以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,以苯酚硫酸法測定總糖含量[4]；以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量[5]；以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量[6]。分子量分布采用高效液相色譜法進(jìn)行測定[4]。

1.2.3 對醋酸導(dǎo)致小鼠扭體的抑制作用實(shí)驗(yàn) 昆明種小鼠(清潔級)，購自吉林大學(xué),合格證號為SCXK(吉)2008-0005，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼用，隨機(jī)分組。樣品以水溶解后各組小鼠每天灌胃給藥1次，模型對照組給與等體積的水，連續(xù)10 d，正常進(jìn)食。末次給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%的醋酸，觀察小鼠20 min內(nèi)的扭體次數(shù)。

1.2.4 大孔樹脂柱層析 樣品P以水溶解，離心后上樣，分別以水(D1)、30%乙醇(D2)、60%乙醇(D3)、95%乙醇(D4)洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮后分別冷凍干燥得到D1、2、3、4等4個部分。

1.2.5 D2部分的純化 樣品D2 200 mg，以水溶解后在Sephadex G-100凝膠色譜柱(60 cm×4 cm)進(jìn)行柱層析。每6 mL為1個流分收集洗脫液，測定其中的糖(酚-硫酸法)和蛋白質(zhì)(UV 280 nm)含量，對洗脫流份作圖，根據(jù)洗脫曲線合并12-25管(D2H)和26-58管(D2L)，凍干，得到純化糖肽。

1.2.6 純化樣品的結(jié)構(gòu)分析[8]采用Hakomori法(箱守法)，利用GC-MS檢測：HP-5石英毛細(xì)管柱為30 mm×0.25 mm，進(jìn)樣口溫度250 ℃。柱溫120 ℃保持5 min，5 ℃/min升到220 ℃，在220 ℃保持20 min。進(jìn)樣量為0.2 μL。采用美國FINGAN公司的Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。紅外光譜在Spectrum紅外光譜儀測定。

2 結(jié)果

2.1 糖蛋白部分的提取和性質(zhì)分析 安絡(luò)小皮傘菌絲體粗糖肽中的糖部分是由葡萄糖和甘露糖組成,摩爾比為1∶9.2。氨基酸分析結(jié)果表明，其中含有10種氨基酸(在樣品中的百分含量)Glu(6.12%)，Asp(10.10%)，Hyp(2.19%)，Ser(3.46%)，Arg(2.01%)，Gly(3.02%)，Thr(0.30%)，Pro(1.33%)，Leu(2.21%)and Lys(0.67%)。

2.2 糖蛋白的分離和理化性質(zhì)分析 見表1。

表1 不同糖蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

2.3 對醋酸導(dǎo)致小鼠扭體的抑制作用實(shí)驗(yàn) 見表2。

2.4 糖蛋白的純化和糖苷鍵分析 見表3。

表2 各樣品對乙酸導(dǎo)致小鼠扭體反應(yīng)的影響(n=10)

表3 D2H和D2L中糖苷鍵連接方式

3 討論

鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，安絡(luò)小皮傘菌絲體中分離得到的糖蛋白類成分具有鎮(zhèn)痛作用，該部分含量占菌絲體的20%以上，是其鎮(zhèn)痛作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。分離得到的樣品P為組成復(fù)雜的糖蛋白，經(jīng)過大孔樹脂分離后，得到的各樣品糖和肽的含量有所不同，組成糖相同但其摩爾比例不同；表明安絡(luò)小皮傘糖肽中多種糖肽具有鎮(zhèn)痛作用；通過凝膠柱層析分離得到的純化糖肽-D2H和D2L具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，進(jìn)而證明糖肽類成分是安絡(luò)小皮傘鎮(zhèn)痛作用的有效成分。對純化糖肽的糖部分進(jìn)行的分析表明，該糖蛋白中糖的部分無論分子量大小，均是由1-4連接Glc為主鏈,在其6位連接由Glc、Man和Gal構(gòu)成的側(cè)鏈；肽部分是由10種氨基酸組成；該鎮(zhèn)痛作用可能來自這些糖肽均具有的共性結(jié)構(gòu)部分。

[1]戴芳瀾.中國真菌總匯[M].北京:科學(xué)出版社,1979:532-534.

[2]方圣鼎,張振德,陳嫌,等.安絡(luò)小皮傘中的鎮(zhèn)痛成分[J].中草藥,1989,20(10):2-4.

[3]陳西廣,張翼伸.安絡(luò)小皮傘中水溶性多糖的研究[J].真菌學(xué)報,1990(2):155-160.

[4]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].2版.杭州:浙江大學(xué)出版社,2003:1-259.

[5]李建武,蕭能庚,余瑞元.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理方法[M].北京:北京大學(xué)出版社,1994.