楊 君，王慧玲，華方方

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指連續(xù)2次及以上的自然流產(chǎn)，是妊娠期婦女的常見并發(fā)癥之一［1］。目前關(guān)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因尚不完全清楚，約80%的流產(chǎn)者不存在生殖道感染、解剖、內(nèi)分泌、遺傳和自身免疫功能異常等病因［2］。妊娠相關(guān)血漿蛋白 A(PAPP－A)是由胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞合成的母體血漿糖蛋白，研究顯示其在早期配子的發(fā)育、受精卵的著床、妊娠的維持以及胎兒和胎盤的生長發(fā)育等方面均發(fā)揮重要作用［3］。其表達(dá)水平隨著孕周的增加而增高，筆者在臨床工作中發(fā)現(xiàn)PAPP－A水平在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦蛻膜組織中的表達(dá)水平低于正常孕婦，本研究即探討了蛻膜組織中PAPP－A水平與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 病例入選標(biāo)準(zhǔn):(1)患者染色體檢查正常，無家族性遺傳病史，家族中未出現(xiàn)過自然流產(chǎn)者;(2)患者生殖道感染檢測呈陰性;(3)抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗精子抗體及抗子宮內(nèi)膜抗體檢查均為陰性;(4)無自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病等;(5)無心腦血管疾病及其他傳染性疾病病史;(6)配偶生殖系統(tǒng)和精液功能正常;(7)無吸煙、酗酒等不良生活習(xí)慣。選擇2010年6月—2012年6月我院收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦39例作為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組 (RSA組)，年齡27～41歲，平均 (33.1±5.4)歲;孕期5～7周，平均(6.1±0.8)周。選擇同時期在我院進(jìn)行人工流產(chǎn)的健康早孕婦女30例作為對照組，年齡23～40歲，平均 (32.1±5.2)歲;孕期為5～8周，平均 (6.5±0.9)周。兩組受試者的年齡、孕周間具有可比性 (t=0.143、0.217，P＞0.05)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 蛻膜組織均通過負(fù)壓吸引術(shù)獲得，于液氮中保存使用;Trizol購自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物;SYBY Green MiX購自羅氏生物;96孔板購自Applied Biosystems;小鼠抗人PAPP－A單克隆抗體購自美國Abcam公司;羊抗鼠二抗購自Santa－cruz公司;DAB顯色液購自北京中杉生物技術(shù)有限公司;蘇木精購自北京中杉生物技術(shù)有限公司;國產(chǎn)分析純試劑;Real－time PCR擴(kuò)增儀購自Applied Biosystems;LEICA RM2245石蠟切片機(jī)購自萊卡上海分公司;OLYMPUSBX5l顯微鏡購自日本奧林巴斯。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熒光定量PCR(RT－PCR)分析PAPP－AmRNA水平

將蛻膜組織從液氮中取出，置于1 ml Trizol試劑中，勻漿后加入200μl的氯仿，振蕩混勻后冰上放置5 min，12 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心15 min，吸取澄清部分加入等體積異丙醇中，混勻后冰上靜置10min，12 000 r/min離心15min，棄上清液，向離心管中加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇溶液，輕輕振蕩5下后8 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用焦碳酸二乙酯 (DEPC)處理的溶液溶解，定量后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為RT－PCR的模板。

PAPP－A引物，上游:5'－CTACTTGGATGTTAATGAGC－3';下游:5'－TCCTGCCAACTCCTCCTCTG －3'。Actin作為內(nèi)參，上游:5'－AGCGGGAAATCGTGCGTGACA－3';下游:5'－GTGGACTTGGGAGAGGACTGG－3'，由上海英俊生物公司合成。引物合成后稀釋為10μM。反應(yīng)體系如下:2×SYBR?Premix ExTaqTM 10μl，上游引物和下游引物各0.6μl，cDNA模板1∶100稀釋后取8.8μl，總體積20μl。按比例配制上述反應(yīng)液后分裝于96孔PCR板，每孔20μl，然后以1 000 r/min離心2 min。PCR反應(yīng)條件如下:預(yù)變性:95℃，30 s;變性:95℃，3 s;退火延伸:60℃，30 s;構(gòu)建溶解曲線。表達(dá)量的計算采用ΔΔt模式。

1.3.2 免疫組化分析PAPP－A水平 將RSA組和對照組蛻膜組織用石蠟包被，切成5μm厚的切片，貼于載玻片上進(jìn)行脫蠟處理，結(jié)束后用磷酸鹽吐溫 (PBST)緩沖液沖洗3次，用3%過氧化氫－甲醇液浸泡除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，PBST緩沖液沖洗3次后將玻片置于檸檬酸緩沖液中，微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后PBST緩沖液沖洗3次，用10%的山羊血清室溫封閉1 h，然后用10%山羊血清稀釋的一抗工作液4℃孵育過夜。次日在室溫回溫1 h后用PBST緩沖液沖洗3次，用二抗工作液室溫孵育30 min，PBST緩沖液沖洗3次后DAB顯色2～10 min，邊顯色邊觀察，著色后用自來水沖洗掉顯色液，蘇木精復(fù)染30 s，然后梯度乙醇脫水并用中性樹脂封固。同時設(shè)立陰性和陽性對照。陽性評定標(biāo)準(zhǔn):所有切片均采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)分析。每張切片隨機(jī)選取10個視野，放大400倍，分析陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，分為4個等級，陰性 (－):陽性細(xì)胞數(shù) ＜5%;弱陽性(+):陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%;中等陽性 (++):陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%;強(qiáng)陽性 (+++):陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。并采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)對標(biāo)本進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用±s)表示，采用t檢驗(yàn);計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)影響因素的分析采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A mRNA水平比較從蛻膜組織中提取的RNA經(jīng)紫外線分析，光密度 (OD)260/OD280為1.9～2.0，說明RNA純度較高，未受到DNA和蛋白質(zhì)污染。并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為RT－PCR的模板。RSA組蛻膜組織中PAPP－A mRNA水平較對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=3.152，P＜0.05，見圖1)。

圖1 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A mRNA水平比較Figure1 Comparison of PAPP－A mRNA between RSA group and control group in basal deciduas tissues

2.2 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A水平比較PAPP－A表達(dá)于蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)中 (見圖2A)。兩組PAPP－A表達(dá)程度間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (u=4.995，P=0.000)，其中RSA組PAPP－A表達(dá)以強(qiáng)陽性為主，對照組主要以弱陽性為主 (P＜0.05，見表1)。對RSA組和對照組標(biāo)本進(jìn)行定量分析顯示，RSA組PAPP－A表達(dá)水平較對照組下降 (t=2.591，P＜0.05，見圖2B)。

2.3 PAPP－A蛋白與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系 以PAPP－A水平、年齡、孕周為自變量，以是否發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示PAPP－A水平是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險因素之一〔b=1.722，OR=5.596，95%可信區(qū)間(2.406，13.017)，P=0.004〕。Hosmer－Lemeshow 擬合優(yōu)度檢驗(yàn)結(jié)果顯示PAPP－A水平對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的預(yù)測具有較好的校準(zhǔn)度 (χ2=3.158，P＜0.05)。

表1 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A的表達(dá)程度比較Table 1 Comparison of PAPP－A protein in RSA group and control group in basal deciduas tissues

圖2 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A的組織分布及水平比較Figure 2 Comparison of PAPP－A protein location and level between RSA group and control group in basal deciduas tissues

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)占妊娠總數(shù)的1%，給孕婦心理和身體造成了極大的損傷，目前已經(jīng)成為臨床研究的焦點(diǎn)［4］。但復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，包括染色體異常［5］、內(nèi)分泌異常［6］、免疫功能異常［7］、生殖器異常、感染因素［8］、全身性疾病、創(chuàng)傷刺激、不良生活習(xí)慣及環(huán)境因素等。但是約80%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)沒有明確的病因［9］。近年來，隨著臨床研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)PAPP－A在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦中表達(dá)異常，因此本研究探討了其與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)之間的關(guān)系，旨在為臨床診斷復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供一定的參考價值。

PAPP－A是與妊娠密切相關(guān)的一類大分子糖蛋白，近年來，研究顯示其在早期胚胎發(fā)育、受精卵著床、妊娠期維持、胎兒和胎盤生長以及發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［10］。PAPP－A主要由胎盤滋養(yǎng)層合體細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞產(chǎn)生，然后分泌入血，從妊娠后第5周起可在孕婦血清中檢測到，并隨著孕周的增加其水平逐漸升高，到妊娠末期達(dá)到最高峰，產(chǎn)后水平逐漸下降［11］。目前PAPP－A已成為臨床早孕診斷和胎兒健康程度的主要監(jiān)測指標(biāo)。筆者在長期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清中PAPP－A水平明顯低于正常孕婦，這一結(jié)果跟目前部分報道一致［12］。

本研究顯示，與對照組比較，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦蛻膜組織中PAPP－A mRNA的水平明顯下降;為了進(jìn)一步分析PAPP－A水平，采用免疫組化的方法分析了蛻膜組織中PAPP－A的表達(dá)變化，結(jié)果顯示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦蛻膜組織中PAPP－A水平明顯低于對照組，蛻膜組織中PAPP－A的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致了入血的PAPP－A水平下降，所以表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清中PAPP－A水平低于對照組孕婦。進(jìn)一步行Logistic回歸分析顯示PAPP－A水平下調(diào)是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險因素，提示其在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷中具有較好的準(zhǔn)確性。

綜上所述，PAPP－A在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)，其下調(diào)是導(dǎo)致發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因之一。

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