單海燕, 張四楊, 趙 心, 李 婉, 于 凱, 白小涓

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Shc相關(guān)磷酸化酪氨酸適配蛋白在大鼠血管衰老中的調(diào)控作用

單海燕1*, 張四楊2, 趙 心1, 李 婉1, 于 凱1, 白小涓3

（中國醫(yī)科大學(xué):1附屬第一醫(yī)院老年病科,2實驗技術(shù)中心三部, 沈陽 110001;3中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病干診科, 沈陽 110004）

探討Shc相關(guān)磷酸化酪氨酸適配蛋白p66shc在血管衰老表達的變化，對闡明血管衰老對動脈粥樣硬化的診治具有重要意義。將Wistar大鼠分為4、10、16、24月齡組，測定各組血漿丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，同時采用恒速注入流體方法測定大鼠頸動脈血管的順應(yīng)性，并利用蛋白免疫印跡法分析各組p66shc、半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶-3水平。隨增齡，大鼠主動脈管壁增厚，纖維化程度增高，MDA濃度明顯升高（與4月齡和10月齡相比，均＜0.01），SOD濃度明顯降低（與4月齡相比，均＜0.01；與10月齡相比，均＜0.05），頸動脈血管的順應(yīng)性增高、彈性速率和彈性面積的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（與4月齡相比，均＜0.01；與10月齡相比，均＜0.05），p66shc、Caspase-3蛋白表達呈時間依賴性上調(diào)。血管衰老性重塑的分子機制之一可能與上調(diào)p66shc、Caspase-3蛋白的表達有關(guān)，進一步闡明其調(diào)控機制可為延緩血管衰老、防治動脈硬化提供理論依據(jù)。

Shc; p66; 半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶-3; 血管衰老; 動脈硬化; 基因調(diào)控

衰老是心血管疾病的獨立危險因素，大量研究指出，血管結(jié)構(gòu)、功能隨增齡發(fā)生改變，即血管衰老直接改變了各種心血管疾病的病理生理機制，從而改變了疾病發(fā)生的閾值、嚴(yán)重程度和預(yù)后。增齡相關(guān)動脈彈性降低常出現(xiàn)于動脈硬化和心血管事件之前，血管衰老改變了各種心血管病發(fā)生的閾值和嚴(yán)重程度，顯著增加了心血管疾病發(fā)生的危險性[1,2]，故增齡成為心血管疾病的首位危險因素。近年來，Shc相關(guān)磷酸化酪氨酸適配蛋白（66-kilodalton isoform of Shc gene products，p66shc）在長壽中的作用引起極大的關(guān)注，p66shc可能在衰老相關(guān)性疾病，如神經(jīng)退化性疾病和老年癡呆癥中起重要的作用[3]，但其引起血管衰老的機制尚不清楚，故本文通過測定衰老大鼠動脈血管順應(yīng)性、p66shc和凋亡相關(guān)基因半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶-3（Cysteinylasparate specific proteinase-3，Caspase-3）的變化，旨在從分子水平闡明動脈衰老的機理，為防治動脈硬化開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

60只健康雄性Wistar大鼠（中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），按月齡分為4組（4、10、16、24月齡組），每組15只，常規(guī)飼養(yǎng)10d。

1.2 主動脈取材

HX-2型小動物血壓計測量鼠尾收縮壓，稱重后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（45mg/kg）麻醉后，開胸心腔取血及胸主動脈組織，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.3 主動脈形態(tài)學(xué)觀察

主動脈常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm，HE染色光鏡下觀察血管一般形態(tài)，HPLAS-1000型圖像分析系統(tǒng)檢測內(nèi)膜中膜厚度、血管內(nèi)徑、內(nèi)膜中膜厚度/內(nèi)徑；Masson染色后分析平滑肌（smooth muscle cell，SMC）、膠原纖維（collagen fiber，CF）在各血管壁中的相對含量（Aa%）。

1.4 血漿丙二醛（malonaldehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測

硫代巴比妥酸法測定血漿MDA，黃嘌呤氧化酶法測定血漿SOD。

1.5 頸動脈順應(yīng)性測定

選定長度為1cm的血管段，一端套在比頸動脈管徑略粗的硬塑料管上，并用手術(shù)縫合線扎緊。硬塑料管與生理記錄儀的血壓換能器連接。整個系統(tǒng)用生理鹽水充滿并排除氣泡。血壓換能器和塑料管通過三通閥門與恒速注射器連通，用1ml注射器配合恒速注射器以3.67μl/s為單位，拉力/斜率以mmHg/s為單位，曲線下面積以μmol/L為單位。這兩個指標(biāo)均以壓力從基線上升至3s這段曲線為計算依據(jù)。斜率與曲線下面積升高表示血管順應(yīng)性下降。

1.6 Western印記法檢測主動脈p66shc、Caspase-3的蛋白水平

取100mg胸主動脈組織放入試管，加入600μl RIPA進行冰浴勻漿，4℃，12000r/min離心10min后上清液至新試管中，再次離心一次，取上清分裝，-20℃保存待用?？捡R斯亮藍法測定蛋白質(zhì)樣品濃度，每個樣品上樣量為20μl，常規(guī)蛋白質(zhì)電泳分離膠濃度為12%（pH8.8），濃縮膠濃度4%（pH6.8），抽提純化的蛋白質(zhì)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過夜，加入一抗（兔抗大鼠p66shc、Caspase-3，1∶100）室溫?fù)u床孵育3h，TBST洗滌后，與二抗室溫?fù)u床孵育0.5h，常規(guī)洗膜化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Alpha Imager圖像處理系統(tǒng)掃描測定感光區(qū)帶平均積分吸光度。β-actin為內(nèi)參照，計算相對含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般狀況

各組大鼠生活狀況良好，體質(zhì)量正常，隨增齡收縮壓呈時間依賴性升高（與4月齡和10月齡比較，＜0.05或＜0.01；表1）。

表1 不同月齡組大鼠收縮壓變化比較

注: 與4月齡組比較,*＜0.05,*＜0.01; 與10月齡組比較,#＜0.05,##＜0.01

2.2 主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

校正收縮壓、體質(zhì)量影響后，4、10、16月齡組內(nèi)膜中膜厚度、內(nèi)徑、內(nèi)膜中膜厚度/內(nèi)徑及膠原纖維、平滑肌含量隨增齡逐漸升高（與4月齡比較，＜0.01；與10月齡比較，＜0.05或＜0.01），但24月齡組與16月齡組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05；表2）。

2.3 血漿MDA、SOD含量及動脈順應(yīng)性

隨增齡，血漿MDA濃度呈時間依賴性升高（與4月齡和10月齡相比，均＜0.01），SOD濃度呈時間依賴性降低（與4月齡相比，均為＜0.01；與10月齡相比，均為＜0.05）；隨增齡，彈性速率和彈性面積升高（與4月齡比較，均＜0.01；與和10月齡比較，均＜0.01；表3）。

2.4 p66shc、Caspase-3蛋白表達

Western印記法顯示，4月齡組僅有微量的p66shc、Caspase-3蛋白表達，其后，它們的表達隨增齡逐漸增高，24月齡組時至高峰（＜0.01，圖1、2）。

圖1 不同月齡大鼠主動脈p66shc蛋白表達的比較

Figure 1 Western blotting analysis of p66shcprotein expression in 4 groups

3 討 論

血管衰老是一種重要而必然的生理現(xiàn)象，其發(fā)生有多方面的因素，與遺傳因素、環(huán)境影響、表觀遺傳修飾和疾病等有關(guān)。血管衰老的生理改變主要是血管順應(yīng)性降低，主動脈血管順應(yīng)性降低是造成老年收縮壓升高的主要原因[1,2,4]。本實驗血管順應(yīng)性測定發(fā)現(xiàn)，衰老組彈性速率和彈性面積升高，其中彈性面積差異統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；氧化應(yīng)激是衰老的重要誘發(fā)原因之一，通過刺激細(xì)胞凋亡，進而引起機體的衰老，而脂褐素是機體氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，其是衰老的重要標(biāo)志產(chǎn)物之一，MDA是脂褐素形成過程的中間產(chǎn)物，它能間接反映機體內(nèi)氧化應(yīng)激過程中脂質(zhì)過氧化水平，MDA升高和SOD下降是衰老的重要表現(xiàn)。大量研究證實，衰老時MDA水平顯著升高而SOD明顯下降，這與本研究結(jié)果相一致[5]。

圖2 不同月齡大鼠主動脈Caspase-3蛋白表達的比較

Figure 2 Western blotting analysis of Caspase-3 protein expression in 4 groups

近年來，國內(nèi)外關(guān)于細(xì)胞衰老的研究主要集中在基因調(diào)控方面的研究，但血管衰老過程中缺乏精確可靠的細(xì)胞和生化標(biāo)志物，阻礙了對血管衰老本質(zhì)及其后繼效應(yīng)的鑒別研究[6,7]。在前期血管衰老的機制研究中，我們課題組已觀察到衰老大鼠血管Caspase-3的mRNA及蛋白表達水平降低可能是血管衰老的重要分子機制之一。本實驗通過對凋亡相關(guān)基因Caspase-3蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，隨增齡Caspase-3表達增強，正常情況下，Caspase-3以酶原形式存在于細(xì)胞中，可經(jīng)線粒體依賴性途徑和細(xì)胞表面死亡受體信號通路激活，活化后的Caspase-3切割蛋白質(zhì)底物，破壞細(xì)胞內(nèi)多種蛋白酶復(fù)合體，激活核內(nèi)核酸酶，造成DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及衰老[5,6]。目前，p66Shc在長壽中的作用引起極大的關(guān)注，p66Shc蛋白是ShcA基因編碼的3種蛋白之一，其余兩種是p46Shc、p52Shc。盡管3種Shc蛋白均屬于酪氨酸磷酸化，并且導(dǎo)致誘導(dǎo)生長因子的產(chǎn)生，但是研究發(fā)現(xiàn)其具有不同的生物學(xué)作用。p66ShcN端包含一個富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域（CH2），研究發(fā)現(xiàn)其在p66Shc調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和凋亡及衰老過程中起到重要的作用。有研究表明：p66shc敲除小鼠可以延長30%的壽命，且對氧化應(yīng)激抵抗增加[3,6]；p66shc突變體小鼠，顯示壽命周期延長，細(xì)胞內(nèi)氧化物產(chǎn)生下降，抵制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生，具有抗心血管疾病、衰老及糖尿病的作用[9,10]。p66shc蛋白是ShcA基因編碼的3種亞型蛋白之一[3,7,8]，研究發(fā)現(xiàn)其參與了氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及衰老等過程的調(diào)控[9-11]。本研究結(jié)果提示，p66shc一方面能促進活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，另一方面能下調(diào)SOD、過氧化氫酶表達水平，導(dǎo)致ROS的水平增多，促進了細(xì)胞凋亡及衰老。在衰老發(fā)生過程中，p66shc參與了線粒體ROS的產(chǎn)生，通過影響線粒體鈣穩(wěn)定，降低膜電位，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放以及Caspase-3活化，而p66shc-ser36磷酸化是這一過程的關(guān)鍵，同時不能排除其他機制參與的可能。

表2 不同月齡組大鼠主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

注: T: 內(nèi)膜中膜厚度; D: 血管內(nèi)徑; T/D: 內(nèi)膜中膜厚度/內(nèi)徑; SMC Aa%: 平滑肌在血管壁中的相對含量; CF Aa%: 膠原纖維在血管壁中的相對含量。與4月齡組比較,**＜0.01; 與10月齡組比較,#＜0.05,##＜0.01

表3 不同月齡大鼠血漿MDA、SOD濃度和主動脈血管順應(yīng)性的比較

注: MDA: 丙二醛; SOD: 超氧化物歧化酶。與4月齡組比較,**＜0.01; 與10月齡組比較,#＜0.05,##＜0.01

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，隨增齡Caspase-3、p66shc的含量均明顯升高，提示二者均參與了氧化應(yīng)激和衰老過程，這可能為將來對延緩血管衰老的研究提供一種新的策略，即通過抑制p66shc/Caspase-3通路來延緩血管老化，為防治動脈硬化開辟新途徑。

[1] Herrera MD, Mingorance C, Rodriguez RR,. Endothelial dysfunction and aging: an update [J]. Ageing Res Rev, 2010, 9(2): 142-152.

[2] Laschober GT, Ruli D, Hofer E,. Identification of evolutionarily conserved genetic regulators of cellular aging[J]. Aging Cell, 2010, 9(6): 1084-1097.

[3] Suski JM, Karkucinska WA, Lebiedzinska M,. p66Shcaging protein in control of fibroblasts cell fate[J]. Int J Mol Sci, 2011, 12(8): 5373-5389.

[4] Tzivion G, Hay N. PI3K-AKT-FoxO axis in cancer and aging[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1813(11): 1925.

[5] 單海燕, 白小涓, 陳香美. 衰老生物學(xué)標(biāo)志的研究進展[J]. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 27(4): 309-312.

[6] Tiberi L, Faisal A, Rossi M,. p66Shc gene has a pro-apoptotic role in human cell lines and it is activated by a p53-independent pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 342(2): 503-508.

[7] Lakatta EG, Levy D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises part I: aging arteries: a "set up" for vascular disease[J]. Circulation, 2003, 107(1): 139-146.

[8] Shan HY, Bai XJ, Chen XM. AngiotensinⅡ induces endothelial cell senescencethe activation of mitogen-activated protein kinases[J]. Cell Biochem Funct, 2008, 26(4): 459-466.

[9] Paneni F, Cosentino F. p66Shcas the engine of vascular aging[J]. Curr Vasc Pharmacol, 2012, 10(6): 697-699.

[10] Afanas'ev I. Reactive oxygen species and age-related genes p66shc, Sirtuin, FOX03 and Klotho in senescence[J]. Oxid Med Cell Longev, 2010, 3(2): 77-85.

[11] Cosentino F, Francia P, Camici GG,. Final common molecular pathways of aging and cardiovascular disease: role of the p66Shcprotein[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008, 28(4): 622-628.

（編輯: 胡曉暉）

Regulatory effects of Shc-related phosphotyrosine adaptor proteins on vascular aging in rats

SHAN Hai-Yan1*, ZHANG Si-Yang2, ZHAO Xin1, LI Wan1, YU Kai1, BAI Xiao-Juan3

(1Department of Gerontology, First Affiliated Hospital;2Department 3, Center of Experimental Technologies, China Medical University, Shenyang 110001, China;3Department of Gerontology and Geriatrics, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, China)

p66shc(66-kilodalton isoform of Shc gene products) gene, encoding a phosphotyrosine signal adapter protein, is confirmed to extend life span by 30%. Our aim was to determine the expression of Shc-related phosphotyrosine adaptor proteins in rat vascular aging in order to elucidate the value of vascular aging in the diagnosis and treatment of atherosclerosis.A total of 60 Wistar rats were divided into 4 groups according to age, that is 4, 10, 16 and 24 months old rats respectively. Aorta plasma levels of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) were detected, and the compliance of rat carotid segment was measured by constant liquid injection. Western blotting was used to detect the expression of p66shcand caspase-3 in the healthy rats of different ages.With aging, aorta wall was thickened with more severe fibrosis. MDA content in the rats of 16 and 24 months old was evidently ascended when compared with 4 and 10 months old (＜0.01), but that of SOD was markedly declined (＜0.01 compared with that of 4 month old rats;＜0.05 compared with that of 10 month old rats). The carotid flexibility was increased, especially flexibility area was significantly different (＜0.01 compared with that of 4 month old rats;＜0.05 compared with that of 10 month old rats). The expression of p66shcand Caspase-3 at protein level was increased in a time-dependent manner.The molecular mechanism of vascular aging might be associated with up-regulaton of p66shcand Caspase-3 with aging. Its underlying mechanism may provide theoretical basis for slowing down of vascular aging, and prevention and treatment of atherosclerosis.

Shc; p66; cysteinylasparate specific proteinase-3; vascular aging; arteriosclerosis; gene regulation

(No.81200245),(No.20122104120003),(No.2012225091, No.201202263),(F10-205-1-44)

R339.3; R592; R541

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00086

2013-04-03;

2013-04-23

國家自然科學(xué)基金（No.81200245）; 高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金聯(lián)合資助課題（No.20122104120003）; 遼寧省科學(xué)技術(shù)研究項目（No.2012225091, No.201202263）; 沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃項目（F10-205-1-44）

單海燕, Tel: 024-83282776, E-mail: shanhy024@163.com