錢大文，周鴻凱 ，江大可，孫澤榮，陳曉宏，袁建活

(廣東海洋大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江524088)

鹽害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最主要的非生物逆境之一［1］，世界上約有20%的耕地和近一半的灌溉地受到鹽脅迫的危害。在全球變暖的大環(huán)境下，全球海平面近10 多年來在加速上升。海平面上升將引發(fā)海水入侵、土壤鹽漬化等問題，從而加劇耕地受鹽脅迫的危害程度。如何利用和開發(fā)鹽漬化土地，提高作物產(chǎn)量和改善生態(tài)環(huán)境是全世界100 多個(gè)國家面臨的重大課題，各國科學(xué)家為此均做出了不懈的努力?？茖W(xué)家們試圖克隆出耐鹽基因并轉(zhuǎn)移到目標(biāo)作物(如水稻、小麥、玉米、甘蔗、大豆等)中，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)作物具有較強(qiáng)的耐鹽性，以保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展。如，Delauney 等［2］通過轉(zhuǎn)入P5CS 基因來提高植物的抗?jié)B透脅迫能力。Sawahel 等［3］通過花粉管法把P5CS 基因?qū)胄←?。Capell 等［4］將多胺合成酶基因轉(zhuǎn)入水稻，提高了水稻的耐逆性。Samis和Bowley［5］將Mn -SOD 基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，其抗逆能力和生物產(chǎn)量皆有提高。植物耐鹽相關(guān)基因的研究主要涉及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、離子區(qū)域化、大分子蛋白、基因表達(dá)的調(diào)控、保護(hù)酶等。

海馬齒(Sesuvium portulacastrum L.)又名濱水菜、蟳螯菜或豬母菜，番杏科海馬齒屬植物，是一種多年生肉質(zhì)喜沙的兼性多年生肉質(zhì)草本植物，生長在海邊沙地或鹽堿地。海馬齒在鹽漬和非鹽漬條件下均能生長，并能完成其生活史，擁有一套有別于淡土植物的遺傳背景和耐鹽堿生理機(jī)制，屬于典型的鹽生植物，其耐鹽特性屬于誘導(dǎo)性狀［6］。對高鹽、干旱和重金屬離子具有很高的耐受性，如Messeddi 等［7］的研究認(rèn)為，即使在高達(dá)1 mol/L 的NaCl 濃度下海馬齒仍能生長，雖生長顯著減緩，但不會導(dǎo)致鹽離子中毒或礦質(zhì)營養(yǎng)元素缺乏等癥狀的發(fā)生。大量資料表明了脯氨酸累積與植物對干旱和鹽脅迫適應(yīng)性之間表現(xiàn)出正相關(guān)性［8］，而海馬齒是一種高積累脯氨酸植物［9，10］，所以海馬齒具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。Ramani 等［11］以液質(zhì)聯(lián)用法研究鹽度對堿苑(Aster tripolium)和海馬齒(Sesuvium portulacastrum)中硫脂物質(zhì)含量的影響，結(jié)果表明，后者較前者具有更強(qiáng)的鹽度耐受性;Inès 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，成年的海馬齒植株對長時(shí)間缺水有很強(qiáng)的忍耐性，在恢復(fù)澆水后能繼續(xù)生長。因此，海馬齒對于鹽堿地的開發(fā)利用、改善生態(tài)環(huán)境、提供耐鹽堿基因等方面，具有很重要的實(shí)際利用潛力。

自20 世紀(jì)八九十年代以來，零星報(bào)道了鹽脅迫下海馬齒植株內(nèi)氨基酸和礦物質(zhì)等組分變化［12-13］，真正的系統(tǒng)研究則始于21 世紀(jì)，對海馬齒耐鹽、耐旱及耐重金屬鎘離子(Cd2+)的生理機(jī)制方面作了較多研究報(bào)道［7，14-15］，并開展分子遺傳多樣性、抗鹽生理與分子機(jī)制、生態(tài)修復(fù)和經(jīng)濟(jì)用途等［16］方面的研究。但是，在鹽脅迫下海馬齒植株內(nèi)脯氨酸合成積累的途徑及其相關(guān)酶的活性方面的研究，仍為鮮見報(bào)道。本文以生長在雷州半島海邊的海馬齒(Sesuvium portulacastrum L.)為材料，初步探討了在鹽脅迫條件下海馬齒植株體內(nèi)游離脯氨酸合成累積的途徑及其P5CS、δ -OAT、SOD、POD 活性，以期為海馬齒的開發(fā)利用、鹽生植物的耐鹽生理機(jī)制探索、發(fā)掘新的耐鹽堿基因提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)材料

于2010 年7 月5 日，在雷州半島流沙灣的海灘上采集野生的海馬齒(Sesuvium portulacastrum L.)回廣東海洋大學(xué)培植，用海水澆灌。兩個(gè)月后，選取生長均勻的植株，均勻剪取15 cm 長的苗莖24 段為種苗。試驗(yàn)的土壤為礫質(zhì)沙土。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽試驗(yàn)的方法，3 次重復(fù)，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。選用高25 cm、口徑30 cm 的花盆，每盆裝干礫質(zhì)沙土2.0 kg;鹽脅迫處理為施用NaCl 溶液。試驗(yàn)在玻璃溫室進(jìn)行，于2010 年9 月5 日，將36 段種苗按每盆2 株分別種入18 個(gè)花盆，種苗入土深度為8 cm，用營養(yǎng)液(體積比1∶1的海水和0.2%荷蘭復(fù)合肥液臨時(shí)混合液)澆淋500 mL。以后每天澆淋營養(yǎng)液200 mL，培育25 d、主莖長度達(dá)25 cm 時(shí)，每天用200 mL 自來水澆5 d 后，按NaCl 的6 個(gè)處理水平(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol·L-1)施用相應(yīng)濃度的溶液200 mL，48 h 后取樣(主莖頂端的嫩莖及葉片為測試樣本，土壤的含水量為8.78% ±0.16%)分析測定。

1.2 測定方法

脯氨酸含量測定按照Bates 等［17］的方法;⊿1-毗咯琳-5 -羧酸合成酶(P5CS)的提取按照Kavi等［8］的方法，P5CS 的活性測定按照Garcia -Rios［18］的方法進(jìn)行;鳥氨酸-δ -氨基轉(zhuǎn)移酶(δ -OAT)的提取按照Delauney 等［2］的方法進(jìn)行，δ -OAT 活性測定按Kim 等［19］的方法;超氧歧化酶(SOD)的測定按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，試劑配置按照說明書操作;過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法［20］。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

本研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS10.3 在PC 機(jī)上進(jìn)行，用Duncan 法測定處理間各生理指標(biāo)的差異顯著性(P ＜0.05)，并在圖中進(jìn)行標(biāo)注。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離脯氨酸積累量分析

圖1 表明，NaCl 處理?xiàng)l件下，海馬齒植物體內(nèi)的游離脯氨酸有顯著的積累效應(yīng):0.2 mol·L-1處理水平的游離脯氨酸量顯著地比0 mol·L-1處理水平(CK)增加14.5%;0.6 mol·L-1水平的游離脯氨酸量達(dá)到高峰值347 μmol·g-1(FW)，比CK 增加達(dá)33.5%;而后游離脯氨酸量開始下降。這一結(jié)果表明，在NaCl 的肋迫下，海馬齒植物體內(nèi)游離脯氨酸的積累量顯著地增加，但在高濃度水平(0.8 mol·L-1)NaCl 的肋迫下，海馬齒的游離脯氨酸的量又顯著地下降。

圖1 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)游離脯氨酸的含量

2.2 δ-OAT 的活性分析

由圖2 可看出，NaCl 的施用對海馬齒體內(nèi)δ -OAT 酶的活性有激活效應(yīng)，但隨NaCl 的施用水平不同，δ-OAT 酶的活性有所差異。0.2mol·L-1處理水平的δ-OAT 酶的活性顯著地比0mol·L-1處理水平(CK)增強(qiáng)3.1%;在0.4mol·L-1水平上δ -OAT 酶的活性達(dá)到最大值，顯著地比CK 增強(qiáng)10.1%;隨后δ-OAT 酶的活性逐步地降低。

圖2 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)δ-OAT 的活性變化

2.3 P5CS 的活性分析

由圖3 可知，NaCl 對海馬齒體內(nèi)P5CS 酶的活性產(chǎn)生顯著的激活效應(yīng)，但由于NaCl 的處理脅迫水平不同，其P5CS 酶的活性有顯著的差異性:0.2 mol·L-1處理水平的P5CS 酶的活性顯著地比0 mol·L-1處理水平(CK)增強(qiáng)26.7%;在0.6 mol·L-1水平上達(dá)到高峰值，比CK 增強(qiáng)46.1%;以后，P5CS 酶的活性顯逐步降低的趨勢。

圖3 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)P5CS 的活性變化

2.4 SOD 的活性分析

圖4 表明，NaCl 的6 個(gè)處理水平上，海馬齒的植物體內(nèi)的SOD 活性有顯著的差異性:0.2 mol·L-1處理水平的植物體內(nèi)的SOD 活性比CK 顯著地增強(qiáng)了70.2%;在0.6 mol·L-1水平上，其植物體內(nèi)的SOD 活性達(dá)到高峰，顯著地比CK 增強(qiáng)了1.38 倍。

圖4 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)SOD 的活性變化

2.5 POD 的活性分析

圖5 表明，NaCl 的6 個(gè)處理水平上，海馬齒的植物體內(nèi)的POD 活性有顯著的差異性0.2 mol·L-1處理水平的植物體內(nèi)的POD 活性比CK 顯著地增強(qiáng)了59.6%;在0.6 mol·L-1水平上，其植物體內(nèi)的POD 活性達(dá)到高峰，顯著地比CK 增強(qiáng)了1.28 倍。

圖5 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)POD 的活性變化

3 討 論

3.1 海馬齒在NaCl 脅迫下，植株內(nèi)游離脯氨酸的合成積累途徑

植物的脯氨酸合成、累積及代謝是一個(gè)受非生物脅迫和細(xì)胞內(nèi)脯氨酸濃度高度調(diào)控的生理生化過程。脯氨酸代謝與生物體內(nèi)的基礎(chǔ)代謝過程相關(guān)聯(lián)，包括合成途徑和降解途徑。脯氨酸的合成途徑發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，而降解途徑發(fā)生在線粒體中，這種代謝的區(qū)域化分布避免了物質(zhì)的無效循環(huán)［21］。雖然對植物體內(nèi)累積脯氨酸的可能途徑看法不一［22-23］，但一般認(rèn)為滲透脅迫過程中高等植物脯氨酸的累積主要是由從頭合成引起的［22］，并且認(rèn)為谷氨酸和鳥氨酸是脯氨酸合成的可能前體。產(chǎn)生脯氨酸的生物合成途徑分別稱為谷氨酸途徑［24］和鳥氨酸途徑［2］。每一個(gè)途徑都受到關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，⊿1-毗咯琳-δ-羧酸合成酶(P5CS)和δ -鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(δ-OAT)分別是這兩個(gè)途徑的關(guān)鍵酶［25，26］。在鹽、干旱、重金屬等逆境的脅迫下，哪一種途徑對脯氨酸累積的影響占據(jù)主導(dǎo)地位，這與植物的種類、生理狀態(tài)和植物體內(nèi)的氮素水平有關(guān)［2，27］。Roosens等［28］以4 周齡的擬南芥為材料的研究表明，鹽脅迫下植株內(nèi)游離脯氨酸的增加主要是由于Glu→Pro途徑引起的，而趙福庚等［29］的研究認(rèn)為，鹽脅迫可以明顯激活大麥幼苗體內(nèi)脯氨酸合成的鳥氨酸途徑，使得Orn→Pro 途徑成為脯氨酸合成積累的主要途徑。余光輝等［30］的研究認(rèn)為，在水分脅迫條件下，脯氨酸累積的規(guī)律性與δ -OAT 的活性變化呈現(xiàn)出很好的相關(guān)性，而與P5CS 的活性呈負(fù)相關(guān)，說明假儉草植物脯氨酸的累積主要受到δ -OAT 的活性調(diào)節(jié)。本研究表明，海馬齒在NaCl 脅迫下，植株內(nèi)的δ - OAT 和P5CS 活性均被顯著地激活，δ -OAT 的活性在0.2 mol·L-1處理水平時(shí)比CK 增強(qiáng)3.1%，在0.4 mol·L-1水平達(dá)到最大值(比CK 增強(qiáng)10.1%);而P5CS 的活性在0.2 mol·L-1處理水平就顯著地比CK 增強(qiáng)26.7%，在0.6 mol·L-1水平上達(dá)到高峰值(比CK 增強(qiáng)46.1%)，并與游離脯氨酸積累量同步。因此，可以推斷:海馬齒受到NaCl 脅迫時(shí)，P5CS 和δ -OAT 的活性均被激活，其植株內(nèi)合成脯氨酸的兩條途徑(Glu→Pro 和Orn→Pro)均被啟動合成積累游離脯氨酸，但是以Glu→Pro 途徑為主，Orn→Pro 途徑為輔。這些研究結(jié)果表明，植物的游離脯氨酸合成積累是一個(gè)十分復(fù)雜的生理生化過程，涉及到多個(gè)基因的表達(dá)，植株內(nèi)游離脯氨酸積累的數(shù)量是多種生理生化反應(yīng)綜合作用的結(jié)果?，F(xiàn)有的研究表明，除脯氨酸的合成酶受激活外，還有其它的一些酶如脯氨酸運(yùn)輸酶［31］、谷氨酰胺合成酶［32］等也參與了脯氨酸的累積過程。因此，高等植物體內(nèi)游離脯氨酸合成積累的機(jī)制，還有待于從植物細(xì)胞信號傳遞、脯氨酸運(yùn)輸、相關(guān)酶的作用機(jī)制等方面的進(jìn)一步研究的揭示和證明。

3.2 海馬齒在NaCl 脅迫下，植株內(nèi)游離脯氨酸的積累效應(yīng)

在NaCl 脅迫下海馬齒植株內(nèi)游離脯氨酸有顯著的積累效應(yīng)，在0.6 mol·L-1處理水平時(shí)達(dá)到積累的高峰值347μmol·g-1(FW)，而后在0.8 mol·L-1的高濃度脅迫水平時(shí)，游離脯氨酸的積累量顯著地降低。同時(shí)，與脯氨酸的合成、代謝有關(guān)的δ -OAT、P5CS、POD、SOD 的活性也呈現(xiàn)出與游離脯氨酸積累量一樣的趨勢，不過δ-OAT 活性在0.4 mol·L-1處理水平達(dá)到高峰期。表明了在一定濃度水平的NaCl 脅迫下，海馬齒植株體內(nèi)δ -OAT、P5CS 的活性均被顯著地激活，合成脯氨酸的兩個(gè)途徑(Glu→Pro 和Orn→Pro)同時(shí)加強(qiáng)合成和積累脯氨酸，促進(jìn)植株體內(nèi)的游離脯氨酸快速積累。同時(shí)，由于植株體內(nèi)的游離脯氨酸快速積累，植株體內(nèi)SOD、POD的活性也被顯著地激活，有效清除O-2、OH 和1O2等活性氧(ROS)的積累，緩解NaCl 導(dǎo)致的氧化脅迫，從而進(jìn)一步提高植物的抗氧化能力。而當(dāng)NaCl 的濃度過高時(shí)，這些酶的活性降低，植株體內(nèi)的游離脯氨酸合成與積累受阻，導(dǎo)致植株體內(nèi)的游離脯氨酸含量下降。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了，海馬齒是一種高度耐鹽植物。海馬齒具有這種高耐鹽特性，正是人類探索、發(fā)掘新的耐鹽堿基因重要來源之一。

［1］ Rhoades J D，Loveday J. Salinity in Irrigated Agriculture［C］∥Steward B A，Nielsen D R. American Society of Civil Engineers Irrigation of Agricultural Crops(Mo no graph 30). New York:American Society of Agronomists，1990:1089 -1142.

［2］ Delauney A J，Hu C A，Kishor P B，et al. Cloning of omithine delta-amitransferas cDNA from vigan aconitifolin by trans-complementation in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis［J］. J Bio Chem，1993，268(25):18673 -18678.

［3］ Sawahel W A，Hassan A H.Generation of transgenie wheat plants producing high level of the Osmoprotectant proline［J］.Biotechnology Letters，2002，24(9):721 -725.

［4］ Capell T，Bassie L，Christou P. Modulation of the polyamine biosynthetic pathway in transgenie rice cinfers tolerance to drought stress［J］.PNAS，2004，101:9909 -9914.

［5］ Samis K，Bowley S. Pyramiding Mn-superoxide dismutase tranagenes to improve persistence and biomass production in alfalfa［J］.J Exp Bot，2002，53(372 ):1343 -1350.

［6］ Zeng H C，Deng L H，Zhang C F. Cloning of salt toleran ce-related cDNAs from them angrove plant Sesuvium portulacastrum L.［J］.J Integr Plant Biol，2006，48(8):952 -957.

［7］ Messeddi D，Sleimi N，Abdelly C. Salt tolerance in Sesuvium portulacastrum［C］∥Horst W J，Schenk M K，Brkert A. Plant Nutrition — Food Security and Sustainability of Agro-ecosystems［M］. Nether lands:Springer Verlag，2001:406 -407.

［8］ Kavi K P B，Hong Z L，Miao G H. Overexpression of ⊿1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants［J］. Plant Physiol，1995，108:1387 -1394.

［9］ Inès S，Dorsaf M，Tahar G，et al. Effects of water deficit on growth and proline metabolism in Sesuvium portulacastrum［J］. Environmental and Experimental Botany，2006，56(3):231 -238.

［10］ Tahar G，Issam N，Inès S，et al. Cadmium effects on growth and mineral nutrition of two halophytes:Sesuvium portulacastrum and Mesembryanthemum crystallinum［J］. Journal of Plant Physiology，2005，162(10):1133 -1140.

［11］ Ramani B，Zorn H，Papenbrock J. Quantification and fatty acid profiles of sulfolipids in two halophytes and a glycophyte grown under different salt concentrations［J］. Zeitschrift Fur naturforschung C-A Journal of Biosciences，2004，59(11 -12):835 -842.

［12］ Joshi A J. Aminoacids and mineral constituents in Sesuvium portulacastrum L. a salt marsh halophyte［J］. Aquat Bot，1981，10:69 -74.

［13］ Venkatesalu V，Raj K R，Chellappan K P. Sodium chlorides tress on organic constituents of Sesuvium portulacastrum L.，a salt marsh halophyte［J］. J Plant Nutr，1994，17(10):1635 -1645.

［14］ Ghnaya T，Nouairi I，SlamaI. Cadmium effects on growth and mineral nutrition of two halophytes:Sesuvium portulacastrum and Mesembryanthemum crystallinum［J］. J plant physiol，2005，1133 -1140.

［15］ Slama I，Ghnaya T，Hessini K. Comparative study of the effects of mannitol and PEG osmotic stress on growth and solute accumulation in Sesuvium portulacastrum［J］. Environ Exp Bot，2007，61(1):10 -17.

［16］ 范偉，李文靜，付桂，等. 一種兼具研究與應(yīng)用開發(fā)價(jià)值的鹽生植物—海馬齒［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2010，18(6):689-695.

［17］ Bates L S，Waldren R P，Teare I D. Rapid determination of free proline for water-stress studies［J］.Plant and Soil，1973，39(1):205 -207.

［18］ Garcia-Rios M，F(xiàn)ujita T，La Rosa P C，et al. Cloning of a polycistronic cDNA from tomato encoding gamma-glutamyl kinase and gamma-glutamyl phosphate reductase［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(15):8249 -8254.

［19］ Kim H R，Rho H W，Park J W，et al. Assay of ornithine aminotransferase with ninhydrin［J］. Anal Biochem，1994，223(2):205 -207.

［20］ 高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］. 西安:世界圖書出版公司，2000.

［21］ Kiyosue T，Yoshiba Y，Yamaguchi-Shinozaki K. A nuclear gene encoding mitochondrial proline dehy-drogenase，an enzyme involved in proline metabolism，is upregulated by proline but downregu-lated by dehydration in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Cell，1996，8:1323 -1335.

［22］ Voetberg G S，Sharp R E. Growth at the maize primary root at low water potentia. Ⅲ. Role of increased proline deposition in osmotic adjustment［J］. Plant Physiol，1991，96:1125 -1130.

［23］ Schwacke R，Grallath S，Breitkreuz K E. LeProT1，a transporter for proline，glycine-betaine and ?-aminobutyric acid in tomato pollen. Plant Cell. 1999，11:377 -391.

［24］ Hu C A A，Delauney A J，Verma D P S. A bifunctional enzyme(⊿1-pryrroline-5-carboxylate synthestase)catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1992，89:9354 -9358.

［25］ Szabados L，Savoure A. Proline a multifunctional amino acid［J］.Trends in Plant Science，2009，15(2):89 -97.

［26］ Lehmann S，F(xiàn)unk D，Szabados L. Proline metabolism and transport in plant development［J］. Amino Acids，2010，39(4):949-962.

［27］ Hervieu F，Le D L，Huaul T C. Contribution of ornithine aminotransferase to proline accumulation inNaCl treated radish cotyledons［J］. Plant Cell Environ，1995，18:205 -210.

［28］ Roosens NHCJ，Thu T T，Iskandar H M. Isolation of ornithine—aminotransferase cDNA and effect of salt stress on its expression in Arabidopsis［J］. Plant Physiol，1998，117:263 -271.

［29］ 趙福庚，孫誠，劉友良.鹽脅迫激活大麥幼苗脯氨酸合成的鳥氨酸途徑［J］.植物學(xué)報(bào)，2001，43(1):36 -40.

［30］ 余光輝，劉正輝，曾富華，等. 脯氨酸累積與其合成關(guān)鍵酶活性的關(guān)系［J］.湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，23(6):57 -60.

［31］ Igarashi Y ，Yoshiba Y ，Takeshita T. Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding proline transporter in rice［J］.Plant Cell Physiol，2000，41:750 -756.

［32］ Brugierea N，Duboisb F，Limamia A M.Glutamine synthetase in the phloem plays a major role in controlling proline production［J］. Plant Cell，1999，11:1995 -2012.