宋海璐，周瓊花，嚴(yán)婷婷，黎入熒，黃鎖義

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院，廣西 百色533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，廣西 百色533000)

夏枯草(Prunella vugaris L.)為唇形科夏枯草屬植物，具有清肝明目、清熱利尿、軟堅(jiān)散結(jié)等功效，常用于治療肝火郁結(jié)、目赤腫痛、肝陽(yáng)上亢、累疬結(jié)核等癥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草含有三萜、甾醇、黃酮、有機(jī)酸、多糖等多種化學(xué)成分，具有抗菌、抗病毒、抗高血壓、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［1］。

近年來(lái)，人們對(duì)生活的要求越來(lái)越高，安全意識(shí)日益增高。目前研究結(jié)果表明許多植物和微生物的色素均具有生理活性，其藥用價(jià)值逐漸被人們認(rèn)識(shí)和開發(fā)，而且為生產(chǎn)各種食用品、化妝品、醫(yī)用藥品等色素產(chǎn)品提供了豐富的原料。天然色素已經(jīng)成為當(dāng)今人們崇尚自然，崇尚安全的世界食品發(fā)展潮流的必然產(chǎn)物［2］，作為一種天然的食品添加劑，它不僅賦予食品色澤，給人以美的享受，對(duì)增加食欲有重要的作用，同時(shí)還是鑒別和評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的基礎(chǔ)［3］。近年來(lái)，夏枯草色素的抗氧化性尚未見報(bào)道，為此，本文以蒸餾水作為提取劑，研究夏枯草色素對(duì)DPPH·、O-2·和·OH 自由基的清除作用以及還原Fe3+能力。

1 儀器與材料

722N 可見分光光度計(jì)(上海精科);電子稱(上海民橋精密科儀器有限公司);HH-SA 數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);DPPH (美國(guó)Signa 公司)。夏枯草購(gòu)自廣西百色市。

2 方法與結(jié)果

2.1 夏枯草色素的提取

取烘干的夏枯草，粉碎至粉末，稱取夏枯草粉末約5 g。選取蒸餾水為提取劑，室溫下浸泡24 h，過濾，去渣［4］，濾液經(jīng)水浴鍋蒸發(fā)得到濃縮膏待用［5］。

2.2 色素提取物清除DPPH 自由基能力

DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，提供H 被還原，顏色發(fā)生變化，由深紫色變?yōu)榈S色，可以用紫外可見分光度法定量測(cè)定。取0.5 mL 新配置的DPPH 溶液［c(DPPH)=6 ×10-4mol/L］置于10 mL 的具塞比色管中，然后加入不同體積的樣品溶液，無(wú)水乙醇定容至5 mL，室溫暗光下反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇調(diào)零，在517 nm 處測(cè)定其吸光度A。以高濃度逐漸稀釋的方式檢測(cè)不同濃度樣品對(duì)自由基的清除率，以自由基清除率為50%時(shí)樣品的濃度(IC50)來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力。IC50越小，表明樣品清除自由基的能力越強(qiáng)。其清除率計(jì)算公式:

其中A1為反應(yīng)時(shí)間t=0 min 時(shí)空白吸光度，A2為反應(yīng)時(shí)間t=30 min 時(shí)的吸光度。

以實(shí)驗(yàn)色素提取液作為樣品用無(wú)水乙醇定容至5 mL 分別測(cè)其對(duì)DPPH 自由基清除的作用，由圖1可以看出，隨著色素濃度的增加，對(duì)DPPH 的清除作用增大，自由基清除率為50%時(shí)樣品的濃度(IC50)為0. 19 mg/mL，濃度較小，表明夏枯草色素清除DPPH 自由基的能力較顯著。

圖1 DPPH 自由基清除率

2.3 色素提取物清除超氧自由基能力

采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定。具體方法如下:取0.5 mol/L、pH8.2 的Tris - HCl 緩沖液4.0 mL 于干燥具塞比色管中，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入不同濃度的待測(cè)品0.2 mL，后均加入2.5 mmol/L 鄰苯三酚(由10 mmol/L HCl 制)0.8 mL，混勻后25 ℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即加入10 mmol/L HCl 2 滴終止反應(yīng)，蒸餾水調(diào)零，在320 nm 處測(cè)定吸光度A。其清除率計(jì)算公式:

其中A0:為加鄰苯三酚但不加樣品時(shí)的吸光度;A1:為加樣品和鄰苯三酚時(shí)的吸光度;A2:為加樣品不加鄰苯三酚時(shí)的吸光度。

從圖2 中可以看出，夏枯草色素提取液對(duì)O-2·有一定的清除作用，隨著夏枯草色素提取液濃度的增加，對(duì)O-2·自由基的清除能力也增強(qiáng)，說(shuō)明當(dāng)色素的濃度增加時(shí)，其清除率也增大。

圖2 超氧自由基清除率

2.4 色素提取物清除·OH 自由基能力

參照Fenton 反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型［6］，利用H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH，由于·OH 具有很高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，若在反應(yīng)體系中加入水楊酸，就能有效地與·OH 結(jié)合，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。反應(yīng)是如下:H2O2+Fe2+→Fe3++·OH+OH-

該產(chǎn)物在510 nm 處有強(qiáng)吸收，若在此反應(yīng)體系中加入具有清除·OH 功能的被測(cè)物，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，從而使有色參物生成量減少，采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在相同體積的反應(yīng)體系(8. 8 mmol/L H2O21 mL，9 mmol/L Fe2+1 mL，9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液1 mL)加入一系列不同濃度的樣品溶液，并以蒸餾水為參比，與試劑空白液為比較，在510 nm 處測(cè)量各濃度下的吸光度，便能測(cè)定被測(cè)物(色素)對(duì)·OH 的清除作用，其清除率計(jì)算公式:

清除率(%)=［(A0-AX)/A0］×100%

本實(shí)驗(yàn)以色素提取液作為樣品，分別取不同體積的樣品定容到10 mL 分別測(cè)其對(duì)·OH 的清除作用。從圖3 中可看出，隨著色素濃度的增加，對(duì)·OH自由基的清除能力也增強(qiáng)。

圖3 ·OH 自由基清除率

2.5 還原Fe3+能力

采用普魯士蘭法測(cè)定樣品還原Fe3+能力。在系列10 mL 具塞比色管中依次加入不同濃度的樣品溶液2.5 mL，2.5 mL 磷酸鹽緩沖液［c(磷酸鹽緩沖液)= 0. 2 mol/L pH6. 6］和2. 5 mL 鐵氰化鉀(1%)，混勻后置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入2.5 mL 三氯乙酸(10%)，混勻后將溶液渾濁離心(3 000 r/min)10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL(0.1%)三氯化鐵溶液，混勻，以試劑空白作參比，在700 nm 處測(cè)定吸光度值，吸光度值增加表明還原能力增強(qiáng)。

由表1 可以看出，隨著色素濃度增大，其吸光度值增加，對(duì)Fe3+還原能力增強(qiáng)。

表1 還原Fe3+能力吸光度值

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)表明，夏枯草色素對(duì)DPPH·、O-2·和·OH三種均具有較好的清除作用，而且對(duì)自由基的清除作用隨著色素液濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)色素的濃度為3.5 mg/mL 時(shí)，其清除率O-2·為4.1%、DPPH·為28.3%、·OH 為17.9%，如圖4 所示。對(duì)自由基的清除能力總體強(qiáng)弱是:DPPH·＞·OH ＞O-2·;對(duì)金屬Fe3+還原能力隨色素的濃度增加而增強(qiáng)。因此，夏枯草色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

近年來(lái)，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點(diǎn)備受青睞，而色素的天然作用引人矚目。我國(guó)擁有豐富的夏枯草資源，夏枯草色素所具有的抗氧化活性使其有望作為天然抗氧化劑和功能性產(chǎn)品而得到開發(fā)利用，是潛在的天然著色劑和理想色素來(lái)源，因此，具有良好的開發(fā)價(jià)值和利用前景。同時(shí)，為今后對(duì)色素的結(jié)構(gòu)修飾和合成、發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物提供理論依據(jù)和重要的參考意義，這必將對(duì)新藥的產(chǎn)生、新抗氧化劑的開發(fā)、應(yīng)用及研究產(chǎn)生較大的影響。

圖4 對(duì)DPPH·、O -2·和·OH 三種自由基清除率的比較

［1］ 席與斌，吳允孚，陳剛.夏枯草多糖的分離及抗氧化活性研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26(6):595 -598.

［2］ 楊合超. 誠(chéng)談天然食用色素的開發(fā)［J］. 農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)，2007，(4):48 -49.

［3］ 曾柏全，鄧子牛，李凱霞，等.藤捻葡萄的色素提取及穩(wěn)定性研究［J］.食品科技，2008，33(3):160 -162.

［4］ 謝燕飛，梁紹蘭，黃鎖義，等.廣西茉莉花葉色素的提取及其理化性質(zhì)研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育，2011，18(2):45 -47.

［5］ 李楠. 黑花生抗氧化性研究［J］. 食品開發(fā)與研究，2012，33(3):107 -109.

［6］ 高昌勇. 迎春花色素提取及抗氧化性研究［J］. 生物技術(shù)，2010，20(1):50 -60.