許明峰，馮羅華，潘樂英，吳 曄

支原體肺炎(MP)是肺炎支原體引起的一種間質性肺炎，常見于5歲以上兒童，近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1-2]，且多見嬰幼兒感染。肺泡表面活性物質相關蛋白(SP)是由肺泡2型細胞分泌產生的[3]，其中肺泡表面活性物質蛋白A(SP-A)是目前研究最多的一種，其作為生物學標志在肺部疾病中有著重要意義[4]。本研究通過檢測MP患兒及非MP患兒的血樣，測定SP-A基因序列，比較rs1059054、rs1136452及rs1136454位點的基因多態(tài)性，旨在探討SP-A基因多態(tài)性與MP患兒易感性的關系，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2011年1—12月在我院住院的MP患兒100例為病例組，其中男58例，女42例；年齡6個月～14周歲；診斷依據(jù)衛(wèi)生部2009年版兒科臨床路徑中兒童MP臨床路徑：臨床癥狀及胸部X線片、胸部CT檢查診斷為肺炎，咽拭子肺炎支原體分離培養(yǎng)陽性，痰培養(yǎng)無其他細菌生長。選擇同期在我院住院的非MP患兒100例為對照組，其中男63例，女37例；年齡13個月～14周歲；咽拭子肺炎支原體分離培養(yǎng)均為陰性，痰培養(yǎng)有或無其他細菌生長。

1.2方法

1.2.1標本采集兩組患兒入院明確診斷后抽取血液標本，檸檬酸鈉抗凝，采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，-70 ℃保存?zhèn)溆?；試劑盒由生工生物工?上海)股份有限公司提供。

1.2.2聚合酶鏈反應(PCR)rs1059054位點上游引物為CTGGAGCCCCTGGTATCCCTGGAGAG，下游引物為GTGGAGAGAAGGGGGAGCCTGGCGA；rs1136452位點上游引物為CTGGAGAGTGTGGAGAGAAGGGGGAG，下游引物為CTGGCGAGAGGGGCCCTCCAGGTGA；rs1136454位點上游引物為GGAGAGAAGGGGGAGCCTGGCGAGAG，下游引物為GGCCCTCCAGGTGAGCAGGGTGGGG。引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以基因組DNA為模板在50 μl體系內進行聚合酶鏈反應(PCR)，反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行DNA測序。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，基因頻率使用直接計數(shù)法統(tǒng)計；Hardy-Weinberg平衡的符合程度和基因型分布的比較采用χ2檢驗；等位基因分布采用優(yōu)勢比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1SP-A基因突變位點測序結果+186位點共計220個堿基對，病例組rs1059054、rs1136452及rs1136454位點變異頻率較高：rs1059054位點表現(xiàn)為純合子CC、純合子TT及雜合子CT(見圖1A)；rs1136452位點表現(xiàn)為純合子CC、純合子GG及雜合子CG(見圖1B)；rs1136454位點表現(xiàn)為純合子AA、純合子GG及雜合子AG(見圖1C)。

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗對照組和病例組rs1059054、rs1136452及rs1136454位點基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，具有群體代表性(見表1)。

2.3SP-A基因型分布兩組rs1059054位點CC、CT、TT基因型分布及C、T等位基因分布比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組rs1136452位點CC、CG、GG基因型分布及C、G等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組rs1136454位點AA、AG、GG基因型分布及A、G等位基因分布比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

注：A為rs1059054位點，B為rs1136452位點，C為rs1136454位點

圖1SP-A基因突變位點測序圖

Figure1Mutations of the SP-A gene sequencing graph

表1　兩組rs1059054、rs1136452及rs1136454位點基因型分布的Hardy-Weinberg平衡(例)

表2　SP-A基因型分布及等位基因分布(例)

注：*為χ2值

3　討論

肺炎支原體是一種常見的兒童呼吸道感染病原體，MP多見于學齡兒童，常年均有發(fā)病，臨床表現(xiàn)多樣，除肺部癥狀外，可表現(xiàn)為多種肺外表現(xiàn)[5]。本研究中病例組患兒出現(xiàn)較多的肺外表現(xiàn)有心肌損害、胸膜炎、皮疹及肝功能損害等，且嬰幼兒患兒例數(shù)明顯增多，有15例患兒年齡<3周歲，年齡最小者僅6個月。MP因其反復性、病程長、肺外并發(fā)癥多等而使患兒病情更加復雜，早期診斷和治療尤其重要。臨床一般通過測定肺炎支原體抗體和支原體培養(yǎng)以明確診斷，但支原體抗體一般在發(fā)病后1周陽性率才較高、1～4周為高峰期。本研究選用咽拭子肺炎支原體分離培養(yǎng)結果作為診斷依據(jù)，具有快速、早期發(fā)現(xiàn)率高的優(yōu)點，其快速鑒定培養(yǎng)基為一種人工合成液體培養(yǎng)介質，組成材料是肺炎支原體結構繁殖所需的蛋白質、磷脂、碳水化合物、膽固醇、微量元素及復合抑菌因子等混合而成，營養(yǎng)豐富、特異性強，作用機制是快速繁殖增長的肺炎支原體分解葡萄糖產酸使培養(yǎng)基pH降低，產生顏色變化來判斷肺炎支原體生長，血樣中其他細菌則因培養(yǎng)基中加入了青霉素、醋酸鉈和生物抑菌劑等而被抑制[6]。MP的治療現(xiàn)在通用的為大環(huán)內酯類抗生素，但關于其治療的療程并無定論，療程不足存在病情反復風險，而療程過長存在肝功能損傷、消化系統(tǒng)反應等不良反應，給患兒及其家長帶來了痛苦。

SP存在于肺泡表面，約占肺泡表面活性物質(PS)的10%，其余90%為脂類及磷脂[7]。SP除能降低肺泡表面張力外，還起著介導宿主防御及炎癥反應等作用，其中以SP-A表達最強烈，且信號最豐富，在調節(jié)肺表面活性物質代謝[8-9]、基因表達、肺內免疫及炎癥反應方面具有十分重要的作用[10]，而SP-A的表達水平與某些肺部疾病直接相關[11-12]，很多學者在肺部疾病中探討過SP-A作為生物學標志的意義[13]。目前，臨床上可以通過檢測血液、肺泡灌洗液、痰液中SP-A水平指導臨床診治及判斷預后，具有非常重要的意義。

在SP-A基因中有許多突變位點，最常見的位點為+186、+655、+667位點。本研究對+186位點(引物序列為F:TTTTCTCTGCAGGCCCCATGGGTGC；R:GGGTTTGTCTGATCCCCATC)測序后，得到220個堿基對序列，再仔細閱讀發(fā)現(xiàn)變異頻率較多的位點分別為rs1059054、rs1136452及rs1136454。統(tǒng)計學分析結果顯示，病例組與對照組rs1059054、rs1136454位點基因型及等位基因的分布存在差異，而rs1136452位點則無差異，初步證明SP-A基因rs1059054、rs1136454位點的多態(tài)性與MP的發(fā)病有一定相關性，但這兩個位點所表達的蛋白及其突變如何影響蛋白的表達仍需進一步探索。

綜上所述，SP-A與許多肺部疾病密切相關，肺泡灌洗液中SP-A的水平檢測可作為判斷肺炎病情輕重程度的指標，并可作為臨床上使用PS制劑替代療法的理論依據(jù)；患兒SP-A基因多態(tài)性可能與MP的發(fā)病有關。但由于現(xiàn)在市場上PS制劑價格昂貴，暫時不可能作為治療重癥MP患兒的常規(guī)手段，距離臨床推廣應用還存在一定差距。同時由于技術原因，本研究未能對患兒肺泡灌洗液及肺泡SP-A水平進行定量分析或設置對照，有待于在今后的研究中進一步深入探索。

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