趙 杰，趙麗娜，趙 靜，張秀軍

橋本甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis，HT)是一種器官特異性自身免疫性疾病，以對(duì)甲狀腺抗原的免疫應(yīng)答和甲狀腺腺體內(nèi)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，其發(fā)病機(jī)制涉及細(xì)胞免疫和體液免疫的異常。近年來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡在HT的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。程序性死亡因子5(programmed cell death 5，PDCD5)是一種重要的凋亡調(diào)控分子，研究發(fā)現(xiàn)PDCD5在凋亡相關(guān)疾病如惡性腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程中起重要的作用。有研究證實(shí)，HT患者甲狀腺細(xì)胞中PDCD5呈陽(yáng)性表達(dá)[1]。本研究采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定了60例HT患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cell，PBMC)PDCD5 mRNA的表達(dá)情況，探討PDCD5與HT發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2006年3—8月內(nèi)分泌門(mén)診或住院HT患者60例(HT組)，其中男8例，女52例；平均年齡(40.2±14.5)歲。根據(jù)臨床表現(xiàn)、甲狀腺功能檢測(cè)結(jié)果、甲狀腺核素掃描結(jié)果等臨床診斷為HT。所選患者均為尚未給予治療的初診患者，且無(wú)其他自身免疫性疾病、腫瘤及其他內(nèi)分泌疾病史。根據(jù)患者外周血血清中抗甲狀腺微粒體抗體(TMAb)水平，將其分為HT1 組(TMAb≤45%)36例和HT2組(TMAb>45%)24例。另選取同期在我院體檢的健康者40例(對(duì)照組)，其中男5例，女35例；平均年齡(38.1±11.3)歲；均與HT組患者的性別構(gòu)成、年齡匹配。

1.2主要試劑淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)；總RNA提取試劑Trizol(北京天為時(shí)代科技有限公司)；莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega Corporation)；2×Taq PCR MasterMix(北京天為時(shí)代科技有限公司)；dNTP、Ribonuclease Inhibitor、DL2000(寶生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1淋巴細(xì)胞的分離取HT組和對(duì)照組肝素抗凝外周血5 ml，按常規(guī)Ficoll密度梯度離心分離PBMC。

1.3.2半定量RT-PCR方法檢測(cè)PDCD5基因的表達(dá)

1.3.2.1總RNA提取細(xì)胞總RNA的提取按Trizol RNA總提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，取適量的RNA進(jìn)行紫外線定量(OD260/OD280)和1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定其完整性，余者在-70 ℃保存。

1.3.2.2cDNA合成以獲得的細(xì)胞總RNA為模板，使用MML-V逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用25 μl反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃水浴1 h，72 ℃水浴10 min，-20 ℃保存。

1.3.2.3引物設(shè)計(jì)與合成利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PDCD5基因引物序列，上游引物：5′-CAA CAG GAA GCA AAG CAC-3′，下游引物：5′-GAT CTT AAC TTC TGT CCT AGA C-3′，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度384 bp。內(nèi)參照β-actin引物序列，下游引物：5′-CCC AGG CAC CAG GGC GTG ATG GT-3′，上游引物：5′-GGA CTC CAT GCC CAG GAA GGA A-3′，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度701 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳法純化。

1.3.2.4PCR擴(kuò)增取2 μl cDNA，分別加入10 pmol特異性PDCD5(或β-actin)上游和下游引物，12.5 μl 2×Taq PCR Master Mix和8.5 μl 雙蒸水，反應(yīng)體系為25 μl。經(jīng)優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 3 min，然后94 ℃變性40 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min結(jié)束反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，BIO-RAD-GD2000凝膠成像系統(tǒng)照相記錄試驗(yàn)結(jié)果，Quantity one軟件分析條帶灰度值。384 bp和701 bp均有條帶顯示時(shí)記作PDCD5 mRNA表達(dá)陽(yáng)性，計(jì)算PDCD5與β-actin RT-PCR產(chǎn)物吸光度比值(RI值)，將RI值作為PDCD5 mRNA的相對(duì)含量。比較對(duì)照組和HT組PBMC PDCD5 mRNA表達(dá)陽(yáng)性率及其相對(duì)含量。然后比較HT1組和HT2組患者甲狀腺功能〔總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)、總甲狀腺素(TT4)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)〕、血清甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)水平及PBMC PDCD5 mRNA表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.1序列測(cè)定PDCD5基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向序列測(cè)定，經(jīng)與Gene Bank對(duì)比，同源性均為100%，證實(shí)PCR產(chǎn)物的正確性。

2.2對(duì)照組和HT組PBMC PDCD5基因的表達(dá)對(duì)照組中，24例(60.0%)健康者PBMC PDCD5 mRNA表達(dá)陽(yáng)性，相對(duì)表達(dá)水平為(0.38±0.08)。HT組中，52例(86.7%)患者PBMC PDCD5 mRNA表達(dá)陽(yáng)性，相對(duì)表達(dá)水平為(0.87±0.19)。HT組患者PDCD5 mRNA表達(dá)陽(yáng)性率、相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.355，P<0.01；t=4.870，P<0.01，見(jiàn)圖1)。

2.3HT1組和HT2組患者甲狀腺功能、血清TGAb水平及PDCD5 mRNA表達(dá)水平比較兩組患者血清TT3、TT4、FT3、FT4水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而兩組患者甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)水平及PBMC PDCD5 mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1、圖1)。

3　討論

PDCD5基因是由北京大學(xué)人類(lèi)疾病基因研究中心從人的白血病細(xì)胞株TF-1中克隆得到的新基因，該基因定位于染色體19q12-q13.1，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，在人類(lèi)50余種組織中均有表達(dá)。PDCD5具有促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡和抑制增殖的效應(yīng)，不僅在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)增加，而且凋亡早期就出現(xiàn)明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象[2]。該因子可與Caspase-3特異性結(jié)合，提高Caspase-3蛋白的活性[3]。單獨(dú)存在時(shí)不具備誘導(dǎo)凋亡的作用，但與其他凋亡誘導(dǎo)劑同時(shí)存在時(shí)則可明顯促進(jìn)凋亡進(jìn)程。

HT是一種常見(jiàn)的自身免疫性甲狀腺病(AITD)，免疫損傷主要累及甲狀腺，最終導(dǎo)致甲狀腺濾泡破壞和甲狀腺功能減退癥，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。最近的研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺細(xì)胞凋亡的調(diào)控異常是導(dǎo)致HT發(fā)病的主要原因之一[ 4-6]。HT甲狀腺細(xì)胞表達(dá)Fas/ FasL[7]，且其表達(dá)量與甲狀腺細(xì)胞和浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞之間的距離呈反比[8]，提示Fas/FasL凋亡通路在HT發(fā)病中起重要作用。Hammond等[9]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了1例正常者、4例HT患者、8例Graves病(GD)患者甲狀腺細(xì)胞Fas的表達(dá)，結(jié)果顯示GD患者和HT患者甲狀腺細(xì)胞凋亡率明顯高于正常者，其中尤以HT患者甲狀腺細(xì)胞凋亡率最高。

注： 1、2為HT1組，3、4、9、10為HT2組，5、6、7、8為對(duì)照組，M為DNA marker

圖1半定量RT-PCR方法檢測(cè) PDCD5 mRNA表達(dá)水平的電泳圖

Figure1PDCD5 mRNA expression in PBMC of patients with HT by RT-PCR

表1　HT1組和HT2組患者甲狀腺功能、TGAb水平及PDCD5 mRNA表達(dá)水平比較

注： TT3=總?cè)饧谞钕僭彼?，TT4=總甲狀腺素,FT3=游離三碘甲狀腺原氨酸，F(xiàn)T4=游離甲狀腺素，TGAb=甲狀腺球蛋白抗體，PDCD5=程序性死亡因子5

細(xì)胞凋亡在維持組織的自身平衡、控制異常細(xì)胞的生長(zhǎng)以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起重要作用，是限制外周循環(huán)中自身反應(yīng)性T細(xì)胞過(guò)度增殖的重要方式。破壞細(xì)胞凋亡平衡將會(huì)引起自身免疫的紊亂，引發(fā)自身免疫性疾病。HT外周血淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜，涉及多種凋亡相關(guān)因子，因此報(bào)道較少。Maruoka等[10]認(rèn)為，病情嚴(yán)重的自身免疫性甲狀腺病患者外周T淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)增高。已報(bào)道PDCD5在正常甲狀腺濾泡細(xì)胞中幾乎未見(jiàn)表達(dá)，在HT甲狀腺濾泡細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，PDCD5參與了HT的發(fā)病過(guò)程[1]。本研究結(jié)果顯示，HT患者和健康者PBMC PDCD5 mRNA表達(dá)的陽(yáng)性率分別為86.7%和60.0%，提示PDCD5在健康者和HT患者的PBMC中普遍表達(dá)，PDCD5可能是對(duì)PBMC(以淋巴細(xì)胞為主)的凋亡有重要作用的管家基因。另外，本研究中HT患者PDCD5 mRNA表達(dá)陽(yáng)性率和相對(duì)表達(dá)水平均高于健康者，提示PDCD5可能是繼Fas、Bcl-2、TRAIL[8]等經(jīng)典凋亡途徑之后又一新的影響HT免疫細(xì)胞凋亡平衡的因子。

HT可產(chǎn)生多種自身抗體并且發(fā)生一系列反映甲狀腺功能的血清激素水平的改變。HT的發(fā)病是一個(gè)慢性過(guò)程，發(fā)病初期比較隱匿，早期表現(xiàn)為類(lèi)似于甲狀腺功能亢進(jìn)的癥狀，表現(xiàn)為T(mén)T3、TT4水平升高，促甲狀腺激素(TSH)水平降低，后期隨著病情的發(fā)展才表現(xiàn)為甲狀腺功能減退癥狀。HT時(shí)TMAb、TGAb升高，TMAb、TGAb是反映HT病情和病情進(jìn)展情況的最主要的指標(biāo)。本研究進(jìn)一步根據(jù)血清TMAb水平，將HT患者分為HT1組和HT2組，發(fā)現(xiàn)HT2組患者TGAb水平及PDCD5 mRNA表達(dá)水平高于HT1組。提示隨著血清TMAb水平的升高，HT患者血清TGAb水平和PBMC PDCD5 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平都相應(yīng)升高。本研究選擇未經(jīng)治療的初診HT患者，隨病情加重PDCD5表達(dá)增加，與其甲狀腺上皮細(xì)胞損傷的病理特征相符，推測(cè)細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致其甲狀腺功能減退的原因之一。PBMC PDCD5 mRNA的表達(dá)水平能夠在一定程度上反映HT的病情進(jìn)展情況。

綜上所述，HT患者PBMC PDCD5 mRNA的表達(dá)上調(diào)，而且隨著病情的加重PDCD5的表達(dá)增加，提示PDCD5可能作為淋巴細(xì)胞凋亡的正調(diào)控因子在HT的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要意義。但是疾病發(fā)生過(guò)程是多種凋亡調(diào)控基因共同作用的結(jié)果，關(guān)于PDCD5如何影響HT凋亡平衡的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

1王海寧，杜穎，洪天配.TF-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因19在橋本病甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá)[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2004，20(2)：119-120.

2Chen YY，Sun RH，Han WL，et al.Nuclear translocation of TFAR19(PDCD5)：an early signal for apoptosis[J].FEBS letter，2001，509(27)：191-196.

3Liu H，Wang Y，Zhang Y，et al.TFAR19，a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF-1，could enhance apoptosis of some tumor cells induced of growth factor withdrawal [J].Biochem Biophys Res Commun，1999，254(1)：203-210.

4Andrikoula M，Vatholomatos G，Tsangaris GT，et al.Fas and Bcl-2 protein expression in thyrocytes of patient with nodular goiter[J].European Journal of Endocrinology，2001，145(4)：403-407.

5Salmaso C，Bagnasco M.Regulation of apoptosis in endocrine autoimmunity：insights from Hashimoto′s thyroiditis and Graves′ disease[J].Ann N Y Acad Sci，2002，966(6)：496-501.

6Chen S，F(xiàn)azle Akbar SM.Analysis of the expression of Fas，F(xiàn)ast and Bcl-2 in the pathogenesis of autoimmune thyroid disorders[J].Cell Mol Immunol，2004，1(3)：224-228.

7劉建夏，秦磊，左劍玲，等.Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡在橋本病發(fā)病機(jī)制中的作用[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2003，19(2) ：107-108.

8Stokes TA，Rymaszeuski M，Arscott PL，et al.Constitutive expression of FasL in thyrocytes[J].Science，1998，279(5359)：2015.

9Hammond LJ，Lowdell MW，Cerrano PG，et al.Analysis of apoptosis in relation to tissue destruction associated with Hashimoto′s autoimmune thyroiditis[J].J Pathol，1997，182(2)：138-144.

10Maruoka H，Watanaba M，Matsuzuka F，et al.Increased intensities of fas expression on peripheral T-cell subsets in severe autoimmune thyroid disease[J].Thyroid，2004，14(6)：417-423.