張亞莉，馮 婕，姜莎莎，李 燕，孫吉平，王慧芳，于琳華，郭尚武

糖尿病是最常見的慢性病之一，已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。隨著社會經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展和人口的老齡化，我國糖尿病患病率近年來呈急劇升高趨勢，已成為糖尿病第一大國，且發(fā)病年齡趨于年輕化[2]。糖尿病腎病是糖尿病的嚴重慢性并發(fā)癥之一，嚴重危害著人類的健康及生命。最近有學者提出把糖尿病腎病看作是一種由代謝和免疫聯(lián)系起來的炎癥性疾病，在其發(fā)病過程中有很多細胞因子及炎性因子參與。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺能夠減輕2型糖尿病腎病大鼠的蛋白尿及腎功能損害，并能使病理改變減輕，對糖尿病腎病具有保護作用[3]。本研究通過觀察單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)及結(jié)締組織生長因子(CTGF)在2型糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達，了解早期糖尿病腎病發(fā)病過程中的炎癥反應及纖維化情況。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑剛斷乳的3周齡SD雄性SPF級大鼠35只，體質(zhì)量35～55 g，由西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)由美國Sigma化學公司生產(chǎn)，兔抗大鼠MCP-1、TGF-β1、CTGF由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，二步法免疫組化檢測試劑由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。各項實驗室指標的檢測均由我院中心實驗室完成。

1.2分組將35只大鼠適應性喂養(yǎng)1周，監(jiān)測血糖均正常。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組14只和糖尿病腎病組21只。對照組大鼠體質(zhì)量為(45.5±6.1)g，糖尿病腎病組為(49.0±4.8)g，差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.550，P>0.05)。

1.3糖尿病腎病動物模型的建立對照組大鼠每日給予常規(guī)飼料，糖尿病腎病組大鼠每日給予高脂飼料，兩組大鼠自由進食和飲水。8周后，采用單純隨機抽樣方法從兩組中各抽取6只大鼠，進行葡萄糖耐量試驗(OGTT)和同步胰島素釋放試驗，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR=空腹血糖(FBG)×對應的空腹胰島素(FINS)/22.5[4]。第10周末，證實糖尿病腎病組大鼠存在胰島素抵抗后，兩組大鼠禁食不禁水12 h，糖尿病腎病組大鼠一次性腹腔注射STZ，35 mg/kg，對照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液[5-6]。給予STZ后3 d、7 d、14 d分別行尾靜脈采血檢測隨機血糖，以隨機血糖>15.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功[6]。糖尿病腎病組中共18只大鼠成模，3只未成模者舍棄。第12周末，將兩組大鼠分別置于代謝籠中，收集尿液，檢測24 h尿蛋白定量，經(jīng)統(tǒng)計學分析證明糖尿病腎病組大鼠24 h尿蛋白定量較對照組高，且注射STZ后較注射前高，說明糖尿病腎病動物模型制備成功(糖尿病腎病模型組共制備成功18只大鼠)，之后兩組大鼠均常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.4標本收集第17周末，將兩組大鼠分別放入代謝籠中，收集24 h尿液并檢測24 h尿蛋白定量。大鼠稱體質(zhì)量后，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，心尖部取血，離心分離血清，檢測尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平。4 ℃的0.9%氯化鈉溶液原位灌洗后迅速摘除左側(cè)腎臟，去除包膜，0.9%氯化鈉溶液沖洗后稱腎重，將腎標本切成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小組織塊，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)連續(xù)切片，進行普通腎臟病理學染色，采用免疫組織化學法檢測腎組織中MCP-1、TGF-β1、CTGF的表達，采用Image-Pro Plus Version 6.0彩色圖像分析處理軟件進行圖像半定量分析，計算平均吸光度，平均吸光度=各視野下陽性吸光度(IA)/陽性面積(Area)。

2　結(jié)果

2.1HOMA-IR對照組HOMA-IR為(4.75±1.00)，糖尿病腎病組為(6.18±0.82)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.698，P<0.05)。兩組大鼠0 min、30 min、60 min、120 min血糖水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；0 min、30 min、60 min、120 min胰島素水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.224 h尿蛋白定量及血糖兩組大鼠注射STZ前24 h尿蛋白定量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，注射第14天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。重復測量的方差分析結(jié)果顯示，注射STZ后3、7、14 d兩組血糖水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表2)。

2.3免疫組織化學對照組大鼠腎小管可見少量MCP-1表達，著色較淺(見圖1A)；糖尿病腎病組大鼠腎皮質(zhì)近端腎小管刷狀緣可見MCP-1表達，著色較深(見圖1B)。對照組大鼠未見TGF-β1表達(見圖2A)；糖尿病腎病組大鼠集合管、遠端小管、近端小管細胞質(zhì)TGF-β1表達明顯增強(見圖2B)。對照組大鼠集合管、遠端小管、近端小管細胞質(zhì)表達少量CTGF，著色較淺(見圖3A)；糖尿病腎病組大鼠上述部位CTGF表明顯增強，著色較深(圖3B)。

注：A為對照組，B為糖尿病腎病組

圖1　兩組大鼠腎組織MCP-1的表達(免疫組織化學法，×400)

表2　兩組大鼠24 h尿蛋白定量和血糖比較

注：▲為F值

注：A為對照組，B為糖尿病腎病組

圖2兩組大鼠腎組織TGF-β1的表達(免疫組織化學法，×400)

Figure2Expression of TGF-β1in renal tissue of the two groups

注：A為對照組，B為糖尿病腎病組

圖3兩組大鼠腎組織CTGF的表達(免疫組織化學法，×400)

Figure3Expression of CTGF in renal tissue of the two groups

2.4半定量分析兩組大鼠腎組織MCP-1、TGF-β1、CTGF平均吸光度比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

Table3Comparison of mean absorbance of MCP-1，TGF-β1and CTGF in renal tissue between the two groups

組別只數(shù)MCP-1TGF-β1CTGF對照組14021±002017±001016±002糖尿病腎病組18029±004020±002020±002t值-5017-4963-3649P值　0000　0000　0003

注：MCP-1=單核細胞趨化蛋白-1，TGF-β1=轉(zhuǎn)化生長因子β1，CTGF=結(jié)締組織生長因子

3　討論

糖尿病是一種全球性疾病，其發(fā)病率呈現(xiàn)顯著上升趨勢[7-8]，中國已經(jīng)成為全球糖尿病第一大國[1]。糖尿病是一種嚴重的慢性、進展性疾病，嚴重地危害著人類的健康。糖尿病腎病已成為終末期腎病的主要原因，中國人群終末期腎病發(fā)生率高[8-9]。糖尿病腎病的發(fā)病機制比較復雜，近幾年炎癥學說備受關(guān)注，已經(jīng)證明糖基化作用、生長因子/細胞因子、血流動力學改變等均參與糖尿病腎病的發(fā)病[10-12]，有學者提出把糖尿病腎病看作是一種由代謝和免疫聯(lián)系起來的炎癥性疾病。細胞因子MCP-1、TGF-β1、CTGF與人類很多疾病的發(fā)生有關(guān)，特別是免疫相關(guān)性疾病，但有關(guān)其在腎臟組織中表達部位及強度的研究報道較少。

單核細胞趨化蛋白(MCPs)是一系列結(jié)構(gòu)相似、具有趨化功能的細胞因子，屬于趨化因子的CC亞族(β亞族)。MCP-1是CC亞族趨化性細胞因子中的重要成員。單核-巨噬細胞、成纖維細胞、腎小管上皮細胞均能產(chǎn)生和分泌MCP-1，MCP-1能夠吸附、趨化單核細胞而對中性粒細胞無作用[13]，同時可活化并促使腎小球上皮細胞、血管平滑肌細胞產(chǎn)生炎性因子，進一步放大腎間質(zhì)炎癥反應[14]。MCP-1與CCR2在炎癥反應、新生血管生成、損傷修復中均有重要作用，MCP-1對CCR2的高親和力可用于檢測亞急性和慢性炎癥損害[13-15]。

TGF-β1首次于1972年被報道，目前報道有6種TGF-β分子，其中TGF-β1是目前研究最多的與疾病相關(guān)的分子，其具有廣泛的功能，在腫瘤[16]、臟器纖維化、創(chuàng)傷修復、炎癥性疾病及自身免疫性疾病[17]等的發(fā)生中具有重要意義，是重要的介導細胞對組織損傷的強效的致纖維化因子。在病理情況下，TGF-β1通過其免疫抑制機制，損傷機體的免疫監(jiān)督機制，使機體失去對自我抗原、外來抗原的正常免疫應答，從而導致疾病的發(fā)生[18-20]。研究表明，TGF-β1可以誘導腎小管上皮細胞的自我吞噬并促進腎小管上皮細胞的凋亡，進而引起腎小管損傷[21-22]。

CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌性多肽，是CCN家族成員之一，可能是TGF-β1下游信號遞質(zhì)，能刺激細胞增殖和細胞外基質(zhì)的形成，并在組織纖維化中起重要作用[23-24]。

本研究采用STZ誘發(fā)2型糖尿病腎病大鼠模型，造模成功后處死大鼠，解剖大鼠進行腎臟病理學染色，并用免疫組織化學的方法檢測其腎組織中MCP-1、TGF-β1、CTGF的表達。在光鏡下可觀察到3種因子在糖尿病腎病組大鼠的腎小管上皮細胞的胞質(zhì)中均有較強的表達，腎小球內(nèi)無表達，而對照組無表達或有極少量的表達，與文獻報道一致[25]。分析其原因可能與這3個細胞因子主要的功能是參與腎臟的纖維化、腎臟間質(zhì)較腎小球易出現(xiàn)纖維化有關(guān)，但本研究觀察時間較短，大鼠模型尚屬糖尿病腎病早期，典型的腎臟病理改變即K-W結(jié)節(jié)未觀察到。用Image-Pro Plus Version 6.0彩色圖像分析處理軟件對腎組織中MCP-1、TGF-β1、CTGF的表達進行圖像半定量分析，結(jié)果顯示，糖尿病腎病組大鼠MCP-1、TGF-β1、CTGF平均吸光度均高于對照組，提示MCP-1、TGF-β1、CTGF參與了糖尿病腎病的發(fā)病過程。在2型糖尿病腎病的早期，腎臟中存在著細胞因子的參與，腎組織纖維化細胞因子表達增強，早期糖尿病腎病腎組織中就存在纖維化。筆者進行的前期實驗結(jié)果顯示：在光鏡下(HE染色、Masson染色、PAS染色)對照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，毛細血管袢開放良好，基底膜無增厚，系膜基質(zhì)無增多；糖尿病腎病組大鼠可見腎小球系膜細胞增生，腎小球基膜增厚，足細胞增生，間質(zhì)有炎性細胞浸潤、間質(zhì)纖維化嚴重，腎小球系膜區(qū)PAS陽性物質(zhì)沉積，呈不均勻的紅染；Masson染色腎小管內(nèi)可見顆粒沉積及空泡變性，腎間質(zhì)增多；而經(jīng)環(huán)磷酰胺治療的大鼠病理改變明顯減輕[3]。

綜上所述，細胞因子及炎性因子參與了2型糖尿病腎病的發(fā)病，糖尿病腎病早期就存在著纖維化改變，為今后采用免疫抑制劑治療2型糖尿病腎病提供了線索和依據(jù)，而細胞毒類藥物如環(huán)磷酰胺等能夠降低2型糖尿病腎病的蛋白尿、腎功能損害及病理改變。但由于本研究觀察時間較短，典型的K-W結(jié)節(jié)未能觀察到，仍需在今后的研究中進一步延長觀察時間，深入探討各種細胞因子在2型糖尿病腎病不同階段的表達情況。

1薄虹，黃頌敏，吳蔚華，等.糖尿病腎病的現(xiàn)狀及對策[J].中華腎臟病雜志，2011，27(6)：464-465.

2馬青云.糖尿病腎病遺傳學研究現(xiàn)狀[J].中華糖尿病雜志，2012，4(1)：7-8.

3張亞莉，姜莎莎，李燕，等.CTX對2型糖尿病腎病的治療作用[J].山西醫(yī)科大學學報，2012，43(8)：571-575，636-637.

4李玉山，劉麗秋.實驗性2型糖尿病腎病大鼠模型研究[J].中國實驗診斷學，2009，13(5)：574-577.

5羅志峰，牟嬌，齊偉，等.4-苯基丁酸對糖尿病腎病大鼠的作用[J].中華腎臟病雜志，2012，26(5)：358-362.

6Tesch GH，Allen TJ.Rodent models of streptozotocin induced diabetic nephropathy[J].Nephrology(Carlton)，2007，12(3)：261-266.

7胡承，虞偉慧，賈偉平.中國人2型糖尿病遺傳學研究的現(xiàn)狀—兼談中西方人群差異[J].中華糖尿病雜志，2012，4(1)：4-6.

8張路霞，王海燕.從流行病學的角度探討我國糖尿病腎病的發(fā)病趨勢及對策[J].中華內(nèi)科雜志，2010，49(9)：804-805.

9呂慶國，童南偉.糖尿病重要臨床進展回顧[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2012，28(4)：271-275.

10劉艷春，劉佳.糖尿病腎病的發(fā)病機制及治療[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志，2011，31(2)：84-86.

11Yeo ES，Hwang JY，Park JE，et al.Tumor necrosis factor(TNF-α)and C-reactive protein(CRP)are positively associated with the risk of chronic kidney disease with type 2 diabetes[J].Yonsei Med J，2010，51(4)：519-525.

12劉海霞，劉奔，劉丹丹，等.慢性炎癥標志物檢測對于2型糖尿病早期腎臟病診斷的臨床意義[J].中國糖尿病雜志，2012，20(2)：108-110.

13鮑榮輝，劉先哲.單核細胞趨化蛋白研究進展[J].醫(yī)學研究雜志，2006，35(4)：58-60.

14Luther SA，Cyster JG.Chemokines as regulators of T cell differentiation[J].Nat Immunol，2001，2(2)：102-107.

15楊立明，許丹，馬威，等.急性冠脈綜合征患者血漿單核細胞趨化因子-1水平的相關(guān)研究[J].中國全科醫(yī)學，2010，13(3)：925.

16馬洪波，黃濤，韓風,等.轉(zhuǎn)化生長因子β1和Smad4蛋白在肝癌組織中的表達及其意義[J].中國全科醫(yī)學，2012，15(8)：2780.

17閆慧明，丁利芳，劉媛，等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1與結(jié)締組織生長因子在類風濕關(guān)節(jié)炎合并肺間質(zhì)病變患者血清中的表達水平及臨床意義[J].中國全科醫(yī)學，2012，15(10)：3268.

18高春芳.TGFβ1基因變異與疾病相關(guān)性研究進展[J].世界華人消化雜志，2007，15(28)：2961-2965.

19Qi MY，Kai-Chen，Liu HR，et al.Protective effect of lcariin on the early stage of experimental diabetic nephropathy induced by streptozotocin via modulating transforming growth factor β1and type Ⅳ collagen expression in rats[J].J Ethnopharmacol，2011，138(3)：731-736.

20馬洪亮，王英，付建峰,等.先天性心臟病伴肺動脈高壓患兒血清中血管內(nèi)皮生長因子與轉(zhuǎn)化生長因子-b1的變化研究[J].疑難病雜志，2011，10(2)：89.

21Xu Y，Yang S，Huang J，et al.Tgf-β1induces autophagy and promotes apoptosis in renal tubular epithelial cells[J].Int Mol Med，2012，29(5)：781-790.

22陳娟娟.血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1和層黏連蛋白在2型糖尿病腎病早期診斷中的應用價值[J].中國全科醫(yī)學，2010，13(6)：1989.

23李勤操，鄭喜邦，王曉輝，等.結(jié)締組織生長因子小干擾RNA的構(gòu)建及其干擾效果的檢測[J].生物技術(shù)通訊，2008，19(3)：347-349.

24趙慧娟，李曉東，孫東立，等.原發(fā)性腎小球腎炎患者尿中結(jié)締組織生長因子的檢測及其臨床意義[J].中國全科醫(yī)學，2010，13(4)：1079.

25馬麗娟，杜國利，呂文魁，等.氯沙坦鉀對 2型糖尿病腎病大鼠腎臟TGF-β1、CD68和MCP-1表達的影響[J].中國病理生理雜志，2012，28(5)：947-950.