王東旭，陳艷艷

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甘草黃酮對大強度耐力運動大鼠腎臟組織Ca2+、Mg2+-ATPase及Bax,Bc1-2蛋白表達(dá)的影響

王東旭1，陳艷艷2

1. 塔里木大學(xué)體育工作部，新疆 阿拉爾，843300；2. 西北大學(xué)體育部,陜西 西安，710069。

目的：探討甘草黃酮對大強度耐力運動大鼠腎臟組織Ca2+、Mg2+-ATPase及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。方法：選取SD雄性健康大鼠24只，隨機分為安靜組、大強度運動組和運動加藥組；采用跑臺訓(xùn)練6周后取材，應(yīng)用試劑盒和免疫組織化學(xué)法測檢測各組大鼠腎臟組織Ca2+、Mg2+-TPase活性及Bax和Bcl-2表達(dá)的變化。結(jié)果：與安靜對照組相比，大強度運動組和運動加藥組腎臟組織Ca2+、Mg2+-TPase活性均呈非常顯著性下降（P<0.01）；其中運動加藥組Ca2+、Mg2+-TPase活性均較大強度運動組具有非常顯著差異性提高（P<0.01）；大強度耐力運動組和運動加藥組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)AI均有不同程度增加；大強度運動組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)（MOD）均呈非常顯著差異性（P<0.01），運動加藥組Bax蛋白表達(dá)（MOD）均呈非常顯著差異性（P<0.01）；運動加藥組Bcl-2蛋白表達(dá)（MOD）與大強度運動組具有非常顯著差異性（P<0.01）；大強度運動組和運動加藥組Bax/Bcl-2比值分布呈不同程度的顯著差異性（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論：甘草黃酮能夠增強對大強度運動大鼠抗氧化能力，降低腎臟組織自由基的產(chǎn)生，抑制組織細(xì)胞的凋亡。

甘草黃酮；大強度耐力訓(xùn)練；腎臟；ATP；Bax；Bcl-2

隨著競技體育的迅猛發(fā)展，運動訓(xùn)練強度和量以及競賽周期的增多，探索和利用運動營養(yǎng)補劑，減輕或消除運動疲勞、增強運動技能一直是運動訓(xùn)練學(xué)和營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。甘草黃酮（glycyrrhiza flavonoids，F(xiàn)G）是從甘草提取物中得到的一類生物活性較強的成分，現(xiàn)代中藥學(xué)研究表明[1，2]，甘草黃酮具有抗腫瘤，抗氧化，抗病原微生物作用、解毒、抗炎、抗病毒、增強免疫機能等作用。眾多研究表明[3-5]，急性、大強度運動及過度訓(xùn)練將引起腎臟缺血再灌注，誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡增加，也可能是造成運動性疲勞和運動性蛋白尿發(fā)生的原因之一。目前關(guān)于中藥補劑對大強度耐力運動腎臟組織的影響報道尚無。本實驗通過建立大強度耐力運動大鼠模型和補充甘草黃酮的實驗手段，采用透射電鏡和生化檢測等手段觀察和分析了甘草黃酮對大鼠腎臟組織Ca2+、Mg2+-ATPase及Bax、Bal-2表達(dá)的影響，為進一步研究運動營養(yǎng)補劑對機體腎臟的保護機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其分組

Sprague-Dawley（SD）雄性健康大鼠36只，體重180-220g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食，動物室濕度23℃±5℃，相對濕度40%-70%，分籠飼養(yǎng)備用。

1.2 實驗?zāi)Ｐ徒?/h3>

實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，以以15 m/min、5min/d運動量對動物進行為期3 d的篩選，淘汰個別不適應(yīng)跑臺訓(xùn)練者。選取其中大鼠24只隨機分為安靜對照組、大強度運動對照組和運動加藥組，每組8只。甘草黃酮購自西安天一生物制品公司，棕黃色粉末，其中總黃酮糖苷含量為75%。加藥組采用甘草黃酮溶于蒸餾水溶液中，灌胃加藥，用量為300mg/kg/d，其它組采用灌服同等量的蒸餾水作為對照。每天訓(xùn)練前以15 m/min的速度做適應(yīng)運動5min后正式訓(xùn)練，訓(xùn)練模型基于Bedford模型結(jié)合實際略加調(diào)整，共為期6w（見表1）。

表1 實驗動物運動方案

運動力竭判定標(biāo)準(zhǔn)為：動物跟不上預(yù)定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動皮帶后拖達(dá)30s，毛刷刺激驅(qū)趕無效。行為特征為呼吸深急、幅度大，神情疲倦，俯臥位，垂頭，刺激后無反應(yīng)。

1.3 動物的處死、取材及樣品制備方法

1.3.1 動物處死與取材 組織勻漿的制備：第6周訓(xùn)練最后一天，用乙醚麻醉后，斷頭處死，取腎臟組織置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污后，稱取適量組織（0.2-1g）按W（g）組織塊重量/V（ml）勻漿介質(zhì)為1/9的比例加取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（0.8%的NaCL溶液）于燒杯中，用眼科小剪刀盡快剪碎組織塊（以上操作均在冰水裕中進行）。手工制備勻漿后，3 000轉(zhuǎn)/min低溫離心15min，分離提取上清液4℃冰箱冷藏。

1.3.2 相關(guān)指標(biāo)的檢測 腎臟組織Ca2+、Mg2+-ATPase指標(biāo)應(yīng)用ATPase試劑盒測定，試劑盒由南京建成生物工程研究生提供。細(xì)胞凋亡采用TUNEL檢測法，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，嚴(yán)格按照說明書操作；蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測，檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，操作完全按試劑盒附帶說明進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草黃酮對大強度運動大鼠腎臟組織Ca2+、Mg2+-TPase的影響

The kidneys of Ca2+, Mg2+-ATP expression in each group on rats

組別nCa2+-ATPaseMg2+-ATPase 安靜對照組大強度運動組運動加藥組8883.790.142.480.20**3.320.15**＃＃3.680.162.400.19**3.260.16**＃＃

**與安靜對照組相比較P<0.01；＃＃與大強度運動組比較P<0.01

Compared with th quiet group at the same time, ＃＃P<0.01

Compared with the high-intensity group at the same time, ＃＃P<0.01.

由表2可知，經(jīng)6周大強度耐力運動，大強度運動組和運動加藥組腎臟組織Ca2+、Mg2+-TPase活性均呈非常顯著性下降（P<0.01）；其中運動加藥組Ca2+、Mg2+-TPase活性均較大強度運動組具有非常顯著差異性提高（P<0.01）。

2.2 甘草黃酮對大強度運動大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

Expression of Bax,Bcl-2 protein expression on nephridial tissue in different groups

組別nAIBaxBcl-2Bax/ Bcl-2 安靜對照組大強度運動組運動加藥組8882.29±0.182.84±0.632.49±0.760.29±0.060.60±0.15**0.44±0.08**0.56±0.080.84±0.07**0.63±0.06＃＃0.51±0.040.70±0.13*0.70±0.12**

*與安靜對照組相比較P<0.05；**與安靜對照組相比較P<0.01。＃＃與大強度運動組比較P<0.01。

Compared with th quiet group at the same time, *P<0.05;**P<0.01. compared with the high-intensity group at the same time, ＃＃P<0.01.

由表3可知，與安靜對照組相比，大強度耐力運動組和運動加藥組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)AI均有不同程度增加；與安靜對照組相比，大強度運動組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞平均光密度值（MOD）均呈非常顯著差異性（P<0.01），運動加藥組Bax蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞平均光密度值（MOD）均呈非常顯著差異性（P<0.01）；運動加藥組Bcl-2蛋白表達(dá)MOD與大強度運動組具有非常顯著差異性（P<0.01）；與安靜對照組相比，大強度運動組和運動加藥組Bax/ Bcl-2比值分別呈不同程度的顯著差異性（P<0.05，P<0.01）。

3 討論

3.1 甘草黃酮對大強度運動大鼠腎臟組織Ca2+、Mg2+－ATPase活性的影響

研究表明[6，7]，ATPase存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，是生物膜上的一種蛋白酶，它在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要的作用，ATPase活力的大小是各種細(xì)胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標(biāo)。線粒體是細(xì)胞呼吸的重要器官，是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣儲存庫，線粒體Ca2+-ATPase水解活性反映線粒體攝入Ca2+的能力，酶活性越大，單位時間內(nèi)線粒體通過Ca2+-ATPase攝入的Ca2+量越多[8，9]。研究表明[10]，鎂離子（Mg2+）是線粒體中許多重要酶的輔助因子，在糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用；Mg2+激活磷酸酶，使得ATP在內(nèi)的有機磷酸基團水解、轉(zhuǎn)移和反應(yīng)，在能量的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移、儲存和利用中發(fā)揮著必不可少的作用。有關(guān)報道[11，12]，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度可能主要依靠細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度的變化調(diào)節(jié)，Mg2+的這一調(diào)節(jié)功能主要是通過肌漿網(wǎng)實現(xiàn)，Mg2+可以與Ca2+競爭肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放通道的活性位點。細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度下降可使肌漿網(wǎng)釋放Ca2+增多，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，另外，胞內(nèi)Mg2+還能抑制線粒體的Ca2+攝取，防止過多Ca2+進入線粒體造成損失[13]。研究報道[14]，甘草中黃酮類成分對能引起生物組織膜因產(chǎn)生過氧化作用而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能損傷的超氧陰離子（O-2·）和羥自由基（OH·）等自由基有明顯的清除作用，從而起到對生物組織的保護作用。甘草中黃酮類成分普遍具有抗氧化活性，可以作為自由基清除劑[15]。

從本實驗檢測結(jié)果可知，與安靜對照組相比，大強度運動組和運動加藥組腎臟組織Ca2+、Mg2+-ATPase活性均呈非常顯著性下降（P<0.01）；其中運動加藥組Ca2+、Mg2+-ATPase活性均較大強度運動組具有非常顯著差異性提高（P<0.01）；由此可見，甘草黃酮補劑對大強度耐力運動所引起的Ca2+、Mg2+-ATPase活性下降具有顯著的抑制作用。分析認(rèn)為，說明甘草黃酮可以有效地改善因長時間大強度耐力運動導(dǎo)致的Ca2+內(nèi)流，減少線粒體Ca2+聚集，保證Ca2+的正常轉(zhuǎn)運功能，維持線粒體和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定，增加ATP的產(chǎn)生和保護細(xì)胞膜的完整性，從而保證細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，以及興奮－收縮偶聯(lián)和維持細(xì)胞膜的完整性等生命活動。提示甘草黃酮能有效提高Ca2+、Mg2+-ATPase的活性，從而保護器官各組織和提供機體能量，防止和延緩機體疲勞。

3.2 甘草黃酮對大強度運動大鼠腎臟組織Bax和Bal-2的影響

細(xì)胞凋亡是一種非炎癥性細(xì)胞死亡，它是細(xì)胞在一定的生理或病理條件下受一系列基因控制的程序化細(xì)胞死亡方式，大強度運動中能源物質(zhì)耗竭、代謝產(chǎn)物堆積及氧化應(yīng)激所造成的自由基損傷等多種因素，均可引起腎細(xì)胞凋亡[16]?，F(xiàn)代研究表明[17]，細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的，Bcl-2蛋白是細(xì)胞凋亡的重要分子機制，Bcl-2和Bax蛋白分別是Bcl-2家族中具有代表性的抑制細(xì)胞凋亡和促進細(xì)胞凋亡因子，兩者主要分布于線粒體膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。Bcl-2是目前最受關(guān)注的且被確認(rèn)的對抗細(xì)胞凋亡的基因，它具有維持線粒體膜穩(wěn)定性[18]、阻止線粒體釋放Caspase和凋亡誘導(dǎo)因子及細(xì)胞色素C[19]，抑制細(xì)胞凋亡的生理功能。Bax是促凋亡基因，Bax直接降低線粒體外膜穩(wěn)定性或與Bcl-2結(jié)合形成異源二聚體結(jié)構(gòu)，阻斷Bcl-2的功用，使Caspase、細(xì)胞C等釋放，促進細(xì)胞凋亡[20]。Bcl-2與Bax的相互作用是凋亡調(diào)控的中心環(huán)節(jié)，其比值大小決定抑制或促進細(xì)胞凋亡的走向。當(dāng)Bax過度表達(dá)時，形成Bax同源二聚體，細(xì)胞趨向凋亡；當(dāng)Bcl-2過度表達(dá)時，形成Bcl-2同源二聚體和Bcl-2/Bax異源二聚體，減少Bax同源二聚體的形成，從而抑制Bax/Bax的促凋亡作用[21]。田振軍[22，23]等在對大鼠的睪丸和腎臟組織影響研究中發(fā)現(xiàn)，大強度訓(xùn)練可引起相關(guān)組織細(xì)胞凋亡明顯增多，Bcl-2表達(dá)高于Bax表達(dá)；張桂蘭[24，25]等同樣研究報道，大強度急性力竭運動引起心、肝、腎組織細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax與Bcl-2比例增高，促進凋亡發(fā)生增加。

從本研究結(jié)果知，經(jīng)6周后，大強度耐力運動組和運動補充甘草黃酮組平均細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）為2.84和2.49均顯著高于安靜對照組2.29，補充甘草黃酮組又低于大強度運動組。運動組和運動補藥組腎臟組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)（MOD）及Bax/ Bcl-2比值較安靜對照組呈不同顯著差異性增高（P<0.01，P<0.05）。由此可見，大強度耐力運動造成腎細(xì)胞凋亡基因Bcl-2和Bax高度表達(dá)，其中補充甘草黃酮組細(xì)胞凋亡指數(shù)和相關(guān)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)顯著低于大強度運動組，中藥甘草黃酮對腎臟組織細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用。分析認(rèn)為，長時間大強度耐力運動改變機體內(nèi)環(huán)境，促進機體內(nèi)能源物質(zhì)耗竭、代謝產(chǎn)物堆積，隨著運動后乳酸生成增多，使機體內(nèi)環(huán)境酸化，產(chǎn)生大量的自由基，引起胞內(nèi)鈣超載，進而引起線粒體膜上PT孔打開，使線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放入胞漿，使凋亡的抑制因子和或促進因子在高水平失平衡，進而引發(fā)細(xì)胞凋亡。補充甘草黃酮組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)和相關(guān)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)（MOD）及Bax/ Bcl-2比值均較運動組有所降低，由此可見甘草黃酮對腎臟細(xì)胞具有保護作用，其機體機制可能與甘草黃酮能夠降低組織中氧自由基的含量，減少自由基對神細(xì)胞的損傷及甘草黃酮在機體內(nèi)經(jīng)代謝可釋放能量供細(xì)胞利用，可改善腎細(xì)胞的能力代謝，減輕Ca2+的運轉(zhuǎn)障礙，從而抑制基因蛋白的表達(dá)等等有關(guān)。

3.3 腎臟組織中Ca2+、Mg2+-ATPase活性與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

現(xiàn)代研究表明[26]，線粒體在脊椎動物的凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用，線粒體膜電位的改變會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡是細(xì)胞凋亡的重要機制之一，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子在細(xì)胞凋亡中起重要作用，其既是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，又是凋亡過程效應(yīng)分子[27]。大量研究表明[28]，許多細(xì)胞在凋亡初期，胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度迅速持續(xù)性升高并隨之出現(xiàn)核酸內(nèi)切酶活化，DNA降解和細(xì)胞死亡。細(xì)胞外鈣離子螯合劑及鈣離子緩沖劑能抑制許多因素誘發(fā)的凋亡，都證明了鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)在啟動細(xì)胞凋亡中具有重要作用[29]。在運動狀態(tài)下，尤其在過度運動和力竭性運動狀態(tài)下，腎臟細(xì)胞自由基產(chǎn)生增加，線粒體Ca2+超載，并發(fā)生缺血、缺氧性損傷，引起腎臟細(xì)胞凋亡[30]。從本研究結(jié)果可知，甘草黃酮對可抑制大強度運動大鼠肝臟組織中Ca2+、Mg2+-ATPase活性的降低，同時降低腎臟相應(yīng)部位細(xì)胞的凋亡和抑制相關(guān)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的過度升高，達(dá)到保護細(xì)胞活性和機體抵御內(nèi)在環(huán)境變化的作用，本研究認(rèn)為這可能與其抗氧化性及提高機體免疫機能的生物活性有關(guān)，其具體機制及其相關(guān)關(guān)聯(lián)性有待于進一步的研究。

4 小 結(jié)

中草藥甘草黃酮可有效抑制大強度耐力運動引起的線粒體Ca2+內(nèi)流，維持線粒體和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定，有效提高Ca2+、Mg2+-ATPase的活性；同時對大強度運動所引起的腎臟組織細(xì)胞凋亡和相關(guān)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的過度升高具有一定程度的抑制作用。

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Effect of High-Intensity Endurance Exercise on Ca2+,Mg2+-ATPase and Bax, Bcl-2 Protein Expression With Glycyrrhiza Flavonoids in rat Nephridial Tissue

WANG Dong-xu1，CHEN Yan-yan2

1. Dept. of P.E.; Tarim University, Xinjiang Alar, 843300, China; 2. P.E. Dept, Northwest University, Shaanxi Xi’an 710069, China.

Objective To explore Glycyrrhiza Elavonoids on the rat nephridial tissue of Ca2+, Mg2+-ATPase and Bax, Bcl-2 protein expression with high-intensity endurance exercise. Methods The twenty-four healthy male rats were randomly divided into quiet groups, high-intensity exercise group and exercise plus Glycyrrhiza Elavonoids group, After 6 weeks of treadmill training, Using the box of reagent and immunity histochemistry examined the changing of Ca2+, Mg2+-ATPase and Bax, Bcl-2 protein expression on each groups . Results Compared with the quiet groups, the activity of Ca2+, Mg2+-ATPase both had significant droped (P<0.01), and the groups of plus drog had very difference increased than high-intendity exerxise groups (P<0.01); High-intensity endurance exercise group and exercise dosing rats AI apoptosis index increased in varying degrees;high-intensity exercise group (MOD) were very significant difference(P<0.01), exercise plus drug group Bac protein expression (MOD)were very significant difference (P<0.01); Exercise plus drug group Bcl-2 protein expression(MOD) with the high-intersity exercise group had significant difference(P<0.01), High-intensity exercise group and exercise plus drug group Bax/Bcl-2 ratio of distribution is significantly difference degrees of difference(P<0.05,P<0.01).

Glycyrrhiza Flavonoids; High-intensity exerxise; Nephridial tissue; ATP; Bax; Bcl-2

1007―6891（2013）05―0030―05

G804.2

A

2012-04-10