戴璇璇 周毅力 劉超 閆東升 王甌晨

miRNAs在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床病理意義

戴璇璇 周毅力 劉超 閆東升 王甌晨

目的 探討甲狀腺乳頭狀癌（PTC）中特征性的miRNA表達譜以及臨床病理意義。方法 對52例PTC及7例良性甲狀腺腫瘤手術(shù)切除標本采用基因芯片技術(shù)及RNA印跡雜交法檢測miRNA的表達，對過表達的miRNA表達水平與PTC臨床病理特征之間的關(guān)系進行分析。結(jié)果 （1）用基因芯片技術(shù)篩檢發(fā)現(xiàn)PTC組織中5例過表達的miRNAs（miR-375、miR-34a、miR-146b、miR-222、miR-31）。（2）RNA印跡雜交法驗證芯片結(jié)果及檢測其他miRNAs結(jié)果顯示：miR-34a、miR-146b、miR-31、miR-21和miR-221在PTC組織中的表達水平較癌旁正常甲狀腺組織顯著升高（P＜0．05）。MiR-146b和miR-221在PTC組織中的過表達率較良性甲狀腺腫瘤組織顯著升高（P＜0．01）。PTC患者中包膜侵犯組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNM分期III-IV期組及AGES系統(tǒng)評分≥5分組miR-221的表達水平均明顯高于相應對照組（P＜0．05或0．01）；而男性PTC患者的miR-146b表達水平明顯高于女性PTC患者（P＜0．05）。結(jié)論 miR-146b、miR-221、miR-21和miR-31的過表達與PTC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；過表達的miR-221和miR-146b與PTC的預后不良有關(guān)。

甲狀腺乳頭狀癌 微小RNA 芯片 RNA印跡雜交法

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類全長約為21～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，這些miRNA能夠識別特定的目標mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，從而參與調(diào)控細胞的生長、增殖、分化、凋亡等生命活動[1]。甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，全球發(fā)病率以每年4%的增幅上升，已躍居頭頸部惡性腫瘤的首位[2]。近年來各國報道甲狀腺癌發(fā)病率的增長多以甲狀腺乳頭狀癌（thyroid papillary carcinoma，PTC）為主[3]。雖然PTC患者預后良好，但是部分患者會復發(fā)，最終死于并發(fā)癥。本研究擬通過尋找與PTC相關(guān)的異常表達的miRNA，特別是與PTC預后相關(guān)的miRNA，探討其在PTC診治中的臨床病理意義。

1 材料和方法

1.1 標本采集 52例PTC及7例良性甲狀腺腫瘤標本均取自2009-01—2010-12溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院術(shù)后病理檢查證實的患者。組織病理類型的判斷標準參照2007版美國癌癥聯(lián)合委員會甲狀腺腫瘤的病理學分類，每例標本留取腫瘤組織和對應的距腫瘤邊緣1cm以上的正常甲狀腺組織，離體后10min內(nèi)置于液氮中保存待檢測。其中1例PTC標本用于基因芯片檢測，其他標本用于RNA印跡雜交檢測。

1.2 主要試劑及探針 miRNA寡核苷酸探針購自Ambion公司；Northern雜交液及抗地高辛抗體購自Roche公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；用以雜交的鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）探針序列為：miR-375：5′-UCACGCGAGCCGAACGAACAAA-3′；miR-34a：5′-AACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3′；miR-146b：5′-AGCCUAUGGAAUUCAGUUCUCA-3′；miR-222：5′-GAGACCCAG UAGCCAGAUGUAGCU-3′；miR-31：5′-CAGCUAUGCCAGCAUCUUGCC-3′；miR-21：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′；miR-221：5′-GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3′；miR-181b：5'-CCCACCGACAGCAAUGAAUGUU-3′；miR-155：5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3′；U6：5′-GCAGGGGCCAUGCUAAUCUUCUCUGUAUCG-3′。

1.3 總RNA提取 取液氮中保存的組織標本，在液氮中研磨至粉狀，按Trizol試劑說明書提取總RNA。用DEPC處理的蒸餾水溶解，采用Beckman公司分光光度儀測定RNA溶液A260/A280比值，計算RNA濃度和純度，A260/A280比值＞1.8方可用于檢測；1%的瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。高質(zhì)量RNA的28S與18S條帶亮度在凝膠中約2︰1。所有RNA樣品置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因芯片檢測 總RNA用PEG方法分離miRNA，利用T4 RNA連接酶進行熒光標記，芯片雜交后用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描儀進行掃描。采用LuxScan3.0圖像分析軟件對芯片圖像進行分析，最后用Significance Analysis of Microarrays（SAM，version 2.1）挑選差異表達基因。本實驗檢測1例PTC組織與癌旁正常組織的近400個miRNA差異表達譜，此過程由北京博奧公司完成。

1.5 RNA印跡雜交法（Northern blot）檢測 先取5mg總RNA，95℃熱變性3min，冰上冷卻，15%丙烯酰胺（含7mol/L尿素）180V預電泳30min，用移液器吹走上樣孔中的尿素，上樣后180V電泳60min。膠、濾紙和尼龍膜組成“三明治”結(jié)構(gòu)，在半干電轉(zhuǎn)儀上以400mA轉(zhuǎn)移1h。轉(zhuǎn)膜后紫外交聯(lián)2min。雜交管中放入適量雜交液，尼龍膜正面朝管中心放入雜交管，68℃預雜交30min，加入探針后42℃雜交過夜。2×SSC（含0.1%的SDS）洗膜3次，每次15min，Washing buffer洗膜10min。封閉液中封閉30min，然后2ml抗地高辛抗體結(jié)合60min，Washing buffer洗膜3次，每次10min。加入Detection buffer反應5min，與化學發(fā)光底物的CSPD結(jié)合后顯色5min，暗室中壓膜曝光。采用Scion Image軟件計算miRNA的表達水平，用（miRNA條帶灰度值-背景灰度值）/（U6條帶灰度值-背景灰度值）表示。

1.6 臨床病理特征 本試驗選擇分析的臨床病理特征為患者性別、年齡、腫瘤大?。ㄖ睆剑⒍嘣钚?、包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、AGES（患者年齡、腫瘤分級、侵犯程度和大?。┫到y(tǒng)評分。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，miRNA表達水平呈偏態(tài)分布，所得數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，在PTC組織與對應癌旁正常組織之間的差異采用配對秩和檢驗；miRNA過表達率在PTC組織與良性甲狀腺腫瘤組織之間的差異采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗；miRNA表達水平與各臨床病理特征的關(guān)系采用兩獨立樣本的秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片技術(shù)檢測miRNA表達的結(jié)果 發(fā)現(xiàn)PTC中miR-375、miR-34a、miR-146b、miR-222和miR-31的表達水平明顯高于癌旁正常組織，達1.75～4.89倍（中位數(shù)2.98倍），如圖1所示。

2.2 Northern blot檢測miRNA表達的結(jié)果 miR-34a、miR-146b、miR-31、miR-21及miR-221在PTC組織中的表達水平明顯高于癌旁正常甲狀腺組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01），見表1。miR-146b和miR-221在PTC組織中的過表達率也明顯高于良性甲狀腺腫瘤組織 [miR-146b為77.27%（17/22）vs14.29%（1/7）；miR-221為82.35%（42/51）vs14.29%（1/7）]，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表2。

2.3 miRNA表達水平與PTC臨床病理特征的關(guān)系 見表3。

由表3可見，miR-221表達水平包膜侵犯者明顯高于無包膜侵犯者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者明顯高于Ⅰ～Ⅱ期者，AGES系統(tǒng)評分≈5分者明顯高于＜5分者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。男性患者miR-146b表達水平明顯高于女性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其他過表達的miRNA的表達水平與在各臨床病理特征兩組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

圖1 基因芯片檢測中miRNA在PTC（A）及癌旁正常組織（B）中的表達水平

表1 PTC組織與癌旁正常甲狀腺組織中miRNA表達水平的比較

表2 PTC組織與良性甲狀腺腫瘤組織中miRNA過表達率的比較[例（%）]

表3 miR-221及miR-146b表達水平與PTC臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

本研究通過基因芯片技術(shù)篩選人類全基因組miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)5個miRNA（miR-375、miR-34a、miR-146b、miR-222、miR-31）在PTC中過表達。由于基因芯片檢測是半定量的檢測手段，特異性不強，本研究采用RNA印跡雜交法驗證芯片篩選的異常表達的miRNA并檢測其他miRNA，最終發(fā)現(xiàn)5個miRNA（miR-34a、miR-146b、miR-31、miR-221、miR-21）在PTC中過表達。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miR-31、miR-21在多種惡性腫瘤中如結(jié)直腸癌、肝細胞癌中過表達[4]。以往的多項研究通過基因芯片和實時RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-31和miR-21在PTC中過表達[5-7]。本研究采用基因芯片及RNA印跡雜交法檢測同樣證實了這個結(jié)果，提示miR-31和miR-21可作為PTC的潛在標志物。miR-34a是p53調(diào)節(jié)系統(tǒng)的一部分，參與細胞凋亡。與以往多項研究認為miR-34a系抑癌基因不同，本研究通過基因芯片技術(shù)及RNA印跡雜交法均提示miR-34a在PTC中的表達明顯高于癌旁正常組織，但miR-34a在PTC和甲狀腺良性腫瘤之間表達水平無統(tǒng)計學差異。由于PTC分化程度高，預后良好，不同于以往研究中分化程度較低的惡性腫瘤或未分化癌，所以miR-34a可能在預測惡性腫瘤預后方面有一定的價值。MiR-31、miR-21的表達水平在PTC不同臨床病理特征者之間均無統(tǒng)計學差異，這可能與臨床收集的樣本數(shù)較少有關(guān)，還需要進一步實驗驗證。

MiR-221定位在Xpl1.3區(qū)，與miR-222基因呈前后排列。He及Sheu等[5-6]通過基因芯片技術(shù)及RT-PCR方法的研究均提示miR-221在PTC組織中過表達。我們采用RNA印跡雜交法也發(fā)現(xiàn)miR-221在PTC中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且在PTC組織中的過表達率明顯高于良性甲狀腺腫瘤組織。分組分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-221過表達與腫瘤侵襲性的臨床病理特征：包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Samaan及Simon等[8-9]的研究發(fā)現(xiàn)，PTC患者初始診斷時30%～65%頸部淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PTC復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而患者的主要死因之一是遠處轉(zhuǎn)移。本研究提示miR-221的過表達還與PTC風險及預后評估系統(tǒng)中的TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及AGES系統(tǒng)評分≈5分有關(guān)。TNM分期法是應用最為普遍，也最為滿意的分化型甲狀腺癌預測系統(tǒng)，Loh等[10]的一項700例各期PTC病例的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，不同TNM分期者復發(fā)率及病死率有明顯統(tǒng)計學差異。張麗麗等[11]的多因素分析認為TNM分期是影響預后的一個獨立因素。目前較常應用的甲狀腺癌風險分級和預后評估系統(tǒng)AGES評分系統(tǒng)，有研究統(tǒng)計20年生存率根據(jù)這一系統(tǒng)評分≤3.99分者為99%，4～4.99分者為80%，5～5.99分者為67%，≈6分者為13%[12]。綜上所述，miR-221過表達與PTC的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-221過表達的PTC病例可能具有更為惡性的生物學行為，提示miR-221可以作為預測PTC預后的一個潛在標志物。Garofalo、Wang及Larson等[13-15]的研究提示miR-221可以抑制PTEN的表達，使細胞內(nèi)PIP3的水平增高，PI3K/Akt的信號轉(zhuǎn)導加強，細胞無限增殖而形成腫瘤，并發(fā)生浸潤及轉(zhuǎn)移。BRAF基因突變可通過NF-κB通路調(diào)控miR-221，miR-221可以與NF-κB通路中p65亞基相結(jié)合促進自身的表達，miR-221在BRAF基因突變組織中過表達，而BRAF基因突變與PTC的侵襲性有關(guān)，包括腺體外侵犯、局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移[16-19]。Visone等[20]發(fā)現(xiàn)miR-221過表達的PTC組織或細胞系中，p27KIP1蛋白水平下降，促進癌細胞的增殖。這些可能都是miR-221可以在PTC中評價預后的分子機制。

MiR-146b位于10號染色體上，與miR-146a具有高度的序列同源性。He及Sheu等[5-6]研究通過基因芯片技術(shù)及RT-PCR方法均提示miR-146b在PTC組織中過表達。我們采用基因芯片篩選及RNA印跡雜交法驗證發(fā)現(xiàn)miR-146b在PTC組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，其在PTC組織中的過表達率明顯高于良性甲狀腺腫瘤組織。此外，PTC組織中男性患者的miR-146b的表達水平明顯高于女性患者，Cunninqham及Jukkola等[21-22]的研究指出男性PTC患者無病生存率低于女性患者，性別是PTC獨立的預后預測因子。因此我們認為，miR-146b可以作為PTC預測預后的另一潛在標志物。Kim、Xing及Chou等[17-19，23]發(fā)現(xiàn)miR-146b在BRAF基因突變組織中表達明顯升高，BRAF基因突變與PTC的侵襲性有關(guān)，這可能是miR-146b在PTC中過表達的一個分子機制。

本研究豐富了PTC的microRNA表達譜，篩選了一組與PTC相關(guān)過表達的miRNA。此外，研究結(jié)果顯示，miR-221和miR-146在預測PTC預后中可發(fā)揮重要的作用。

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Expression of specific miRNAs in papillary thyroid carcinomas and their clinicopathological significance

Objective To investigate expression of specific miRNAs in papillary thyroid carcinoma (PTC)and their clinicopathological significance．Methods Fifty two surgical specimens of PTC tissues and 7 specimens of benign thyroid tumor tissues were collected．The miRNA expression levels were detected by using microarray and Northern blot．The correlation between over-expressed miRNAs and clinicopathological features of PTC were analyzed．Results A set of 5 over-expressed miRNAs (miR-375,miR-34a,miR-146b,miR-222,miR-31)was distinguished by microarray in PTC tissues compared to cancer-adjacent tissues．Using Northern blot,the results of microarray were verified;and Northern blot results also showed that the expression levels of miR-34a,miR-146b,miR-31,miR-221 and miR-21 in PTC were significantly higher than those in cancer-adjacent tissues(P＜0．05)．Additionally,the over-expression rates of miR-146b and miR-221 in PTC tissues were significantly higher than those in benign thyroid tumor tissues(P＜0．01)．The expression levels of miR-221 in PTC patients with extrathyroidal invasion, lymph node metastasis,advanced TNM stage (III-IV)and AGES score≥5 were significantly higher than those in control groups (P＜0．05 or 0．01);whereas the expression level of miR-146b in male PTC patients was significantly higher than that in female PTC patients(P＜0．05)．Conclusion Over-expression of miR-146b,miR-221,miR-21,and miR-31 may be associated with carcinogenesis and progression of PTC,and the over-expression of miR-221 and miR-146b are also correlated with poor clinical outcome of PTC patients．

Papillary thyroid carcinoma MiRNAs Microarray Northern blot

2013-07-16）

（本文編輯：沈叔洪）

浙江省自然科學基金資助項目（Y13H160115）

325000 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科（戴璇璇、周毅力、劉超、王甌晨）；溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院（閆東升）

王甌晨，E-mail:woc099@sina.com