王黎芳 趙宏光 李昕如 伊媛琪

FasL基因-844T/C單核苷酸多態(tài)性與浙江地區(qū)食管鱗癌易感性關(guān)系的研究

王黎芳 趙宏光 李昕如 伊媛琪

目的 研究FasL基因啟動子區(qū)-844T/C單核苷酸多態(tài)性（SNP）與食管鱗癌易感性的關(guān)系。方法 提取248例食管鱗癌患者（患者組）和297例健康體檢者（對照組）外周血基因組DNA，以PCR-RFLP檢測FasL-844T/C SNP。分析、比較兩組該位點(diǎn)SNP的表達(dá)差異。結(jié)果 食管鱗癌患者與健康體檢者的FasL基因啟動子區(qū)-844位點(diǎn)基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。以TT基因型為對照，TC基因型不增加食管鱗癌患病風(fēng)險（P＞0．05），而CC基因型則顯著減少食管鱗癌患病風(fēng)險（調(diào)整后OR=0．425，95%CI=0．255～0．708，P＜0．01）。以T等位基因為對照，C等位基因顯著減少食管鱗癌患病風(fēng)險（調(diào)整后OR=0．597，95% CI=0．460～0．776，P＜0．01）。結(jié)論 在浙江地區(qū)人群中FasL基因-844T/C SNP與食管鱗癌的易感性有關(guān)。

FasL基因 單核苷酸多態(tài)性 食管癌

細(xì)胞凋亡對人體器官發(fā)育、機(jī)體穩(wěn)態(tài)及維持器官正常功能均發(fā)揮著重要的作用。研究顯示，凋亡途徑調(diào)節(jié)缺陷可導(dǎo)致腫瘤形成、浸潤及轉(zhuǎn)移[1]。細(xì)胞凋亡途徑中關(guān)鍵基因的遺傳學(xué)變異可影響腫瘤易感性。Fas-Fas配體（Fas ligand,FasL）系統(tǒng)是細(xì)胞和組織凋亡的主要途徑，同時在免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，在癌發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。FasL是腫瘤壞死因子超家族的一員，與其受體Fas交聯(lián)后能觸發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)，引起Fas抗原表達(dá)細(xì)胞凋亡。FasL表達(dá)的增加會推動細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及進(jìn)展。影響凋亡信號傳導(dǎo)的FasL基因功能性突變與多種類型癌發(fā)生的危險性相關(guān)[2]。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）對腫瘤的遺傳易感性起到了重要作用。功能性SNP能改變基因表達(dá)及酶活性，影響腫瘤患病風(fēng)險。Fas或FasL途徑的SNP能夠改變FasL的表達(dá)，在腫瘤遺傳易感性中起到重要作用。本研究擬通過檢測浙江地區(qū)食管鱗癌患者FasL基因啟動子區(qū)-844T/C（rs763110）SNP，探討該基因SNP與食管鱗癌易感性的關(guān)系，以期為食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2008-01—2011-10收治入浙江省腫瘤醫(yī)院胸外科的食管鱗癌患者248例（患者組）。男215例，女33例，年齡46～76（61.4±6.5）歲。另選擇同期健康體檢者297例（對照組），男179例，女118例，年齡41～78（56.6±7.9）歲。在知情同意的情況下，每例抽取外周血3ml，肝素抗凝。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA 按照Blood Genome DNA Extraction Kit（購買自日本Takara公司）的操作說明提取基因組DNA。提取的樣本DNA以TE緩沖液溶解，于-20℃保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增引物引物序列如下：正向引物（Fw Primer）：5′-CAGCTACTCGG AGGCCAAG-3′；反向引物（Rev Primer）：5′-GCTCTGAGGGGAGAGACCAT-3′。引物由上海英維杰基生物有限公司合成。PCR擴(kuò)增試劑盒購自美國Invitrogen公司。反應(yīng)體系（100μl）為：PCR Premix 50μl，F(xiàn)w Primer 1μl，Rev Primer 1μl，DNA模板2μl，滅菌雙蒸水46μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，隨后94℃變性30s、62℃退火30s、72℃延伸45s共35個循環(huán)，72℃最終延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl PCR產(chǎn)物于3%瓊脂糖（購買自日本Takara公司）凝膠電泳分析，Gelred（購買自美國Biotium公司）染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶，以確保有效擴(kuò)增。隨機(jī)抽取各組樣本量10%的PCR產(chǎn)物送上海生工測序，測序結(jié)果應(yīng)用 Pubmed BLAST程序（http://blast/ncbi/nlm/nih/gov/ Blast/cgi）搜索同源序列，確認(rèn)目的片段擴(kuò)增無誤。

1.2.3 限制性片段長度多態(tài)性檢測 按照DNA Fagment Purification Kit（購買自日本Takara公司）操作，對PCR后的產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后產(chǎn)物于3%瓊脂糖電泳下進(jìn)行分析，確保有效純化。膠回收純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以限制性核酸內(nèi)切酶BsrDI（購買自美國NEB公司）酶切。酶切反應(yīng)體系（20μl）為：10×NEB緩沖液2μl，DNA 6μl，100×BSA 0.2μl，內(nèi)切酶0.5μl，滅菌雙蒸水11.3μl；65℃水浴酶切4h。酶切產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠電泳分析，Gelred染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以頻數(shù)與百分率表示。Hardy-Weinberg平衡檢測樣本人群該基因是否符合遺傳平衡法則而具有恒定性。不同基因型患者的年齡、性別等差異比較均采用χ2檢驗。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗。

2 結(jié)果

2.1 FasL-844T/C多態(tài)性檢測 以248例患者和297例健康人外周血基因組DNA為模板擴(kuò)增FasL-814啟動子區(qū)，目的片段長度為401bp（圖1）。經(jīng)BsrDI酶切，TT未突變純合子（野生型）能完全被酶切，電泳條帶為二條122bp、104bp；CC突變純合子（突變型）不能被酶切，電泳條帶為一條，分子量大小為401bp；TC雜合子電泳條帶包含以上3種分子量條帶（圖2）。隨機(jī)送樣本測序進(jìn)一步驗證-844位突變（圖3）。

圖1 PCR擴(kuò)增FasL啟動子區(qū)（1～7：患者組樣本，M：DNA Marker）

圖2 BrsDI酶切檢測FasL基因-844T/C多態(tài)性（2、4、6、8、10、12、14、16、19、22：未酶切產(chǎn)物；1、3、13、15、17、21、23：TT純合子；5、9、11、18、20：TC雜合子；7：CC純合子；M：DNA Marker）

2.2 基因頻率分析及SNP與食管鱗癌關(guān)系分析 患者組和對照組在年齡、性別構(gòu)成中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。患者組及對照組的TT、TC和CC 3種基因型構(gòu)成比以及等位基因頻率的比較見表1。鑒于隨機(jī)樣本在年齡與性別上差異有統(tǒng)計學(xué)意義，故在測算患病風(fēng)險率（OR值）時以年齡和性別參數(shù)加以調(diào)整。

由表1可見，兩組間三種基因型的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=2.663，P=0.103＞0.05），表明所選樣本具有群體代表性?；颊呓M基因型TT∶TC∶CC=27.8%∶44.4%∶27.8%，對照組TT∶TC∶CC=17.5%∶43.1%∶39.4%，兩組基因型比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）?；颊呓MT等位基因∶C等位基因=50.0%∶50.0%，對照組T等位基因∶C等位基因= 39.1%∶60.9%，兩組基因頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。以TT基因型為對照，TC基因型不增加食管鱗癌患病風(fēng)險，其OR值為0.957，95%CI為0.599～1.527，P=0.852。調(diào)整后的 OR值=1.081，95%CI為0.640～1.826，P=0.771。而CC基因型則顯著性減少食管鱗癌患病風(fēng)險，OR值為0.436，95%CI為0.271～0.702，P=0.001；調(diào)整后OR值=0.425，95%CI為0.255～0.708，P=0.001。以T等位基因為對照，C等位基因顯著性減少食管鱗癌患病風(fēng)險，OR值為0.587，95%CI為0.454～0.758，P=0.000；調(diào)整后OR值=0.555，95%CI為0.419～0.735，P＜0.01。

圖3 FasL基因-844T/C PCR產(chǎn)物測序（A：122為G B：123為T）

表1 兩組基因型構(gòu)成及等位基因頻率的比較[例（%）]

2.3 不同研究數(shù)據(jù)的差異分析 將以上數(shù)據(jù)與Sun等[19]報道的FasL基因啟動子區(qū)-844T/C SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行對照分析，見表2。

表2 本文數(shù)據(jù)與Sun等報道的數(shù)據(jù)的對照分析

由表2可見，患者組與對照組在基因型的比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；患者組的基因型比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

FasL基因定位于染色體1q23,包含4個外顯子。它是一種40kD（281個氨基酸殘基）的二型細(xì)胞表面糖蛋白，包括胞漿區(qū)，跨膜區(qū)以及胞外區(qū)。FasL的胞外區(qū)與FAS的胞外區(qū)結(jié)合，能觸發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)，引起Fas抗原表達(dá)細(xì)胞的凋亡。FasL主要表達(dá)于NK細(xì)胞、激活的T細(xì)胞，以及眼、腦、生殖器官等免疫豁免細(xì)胞。FasL具有高度的多態(tài)性。研究最廣泛的多態(tài)性是位于FasL啟動子區(qū)-844T/C（rs763110）。此功能多態(tài)性位于假定的CAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合模體。FasL-844T＞C能影響FasL的啟動子活性，這種變異能強(qiáng)烈影響FasL的表達(dá)。FasL-844 C等位基因比FasL-844 T等位基因人群的FasL基礎(chǔ)表達(dá)增高[3]。提示FasL-844 T/ C多態(tài)性會影響FasL的表達(dá)及FasL介導(dǎo)的信號，最后影響腫瘤易感性。

人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中有FasL表達(dá)增多現(xiàn)象[4-6]，F(xiàn)asL表達(dá)的增高與腫瘤形成、腫瘤侵襲行為以及免疫逃逸有關(guān)。腫瘤組織中FasL表達(dá)增高與各種腫瘤預(yù)后不良有關(guān)。動物實驗顯示，以FasL的抗體阻斷FasL的作用將導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷以及克隆形成效價顯著性減少[7]。

FasL高表達(dá)可通過兩種機(jī)制造成免疫逃逸：（1）通過殺傷Fas敏感的淋巴細(xì)胞來增加腫瘤細(xì)胞反攻免疫系統(tǒng)的能力，從而與癌的發(fā)展有關(guān)[4-8]。（2）T淋巴細(xì)胞的激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（Activation-induced cell death，AICD）可以造成淋巴細(xì)胞的自身凋亡，幫助腫瘤細(xì)胞逃逸T淋巴細(xì)胞的殺傷作用。FasL-844C等位基因?qū)е耇淋巴細(xì)胞FasL高表達(dá)，這可以使T淋巴細(xì)胞的AICD作用增強(qiáng)，導(dǎo)致有效的免疫監(jiān)視作用減弱，從而增加腫瘤的易感性[9]。

研究顯示，F(xiàn)asL-844T/C SNP與肺癌、宮頸癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤患病風(fēng)險增加有關(guān)[10-14]。有一項薈萃分析提示，F(xiàn)asL-844C等位基因與增加腫瘤的患病風(fēng)險相關(guān)[15]。另一項病例對照研究提示，F(xiàn)asL-844T等位基因可能對腫瘤的患病風(fēng)險起到了保護(hù)作用[16]。但也有研究顯示不同的結(jié)論。Ter-Minassian等[17]研究發(fā)現(xiàn)，60歲以下FasL-844 T/C或T/T基因型人群與C/C基因型人群相比較，非小細(xì)胞肺癌患病風(fēng)險顯著增高。Lei等[18]研究發(fā)現(xiàn)FasL-844 CT/TT基因型與FasL-844CC基因型相比較，能顯著增加頭頸部鱗癌后第二原發(fā)性癌的患病風(fēng)險。Sun等[19]研究了588例食管鱗癌患者的的FasL-844T/C SNP與食管鱗癌易感性的關(guān)系，并以648例健康人作為正常對照。研究顯示，F(xiàn)asL-844 CC基因型人群與FasL-844TT基因型人群相比較，食管鱗癌患病風(fēng)險顯著增高。

本研究顯示患者組和對照組無論是在基因型還是等位基因頻率上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。按照基因型進(jìn)行比較，以TT基因型為對照，CC基因型的粗OR為0.436，考慮到年齡和性別在兩組間有差異，根據(jù)年齡、性別調(diào)整后的OR為0.425，差異依然有統(tǒng)計學(xué)意義。提示CC基因型是食管鱗癌易感性的保護(hù)性因素。按照等位基因頻率進(jìn)行比較，C等位基因也是食管鱗癌易感性的保護(hù)性因素。

本研究與Sun等報道的FasL-844 T/C SNP與食管鱗癌易感性相關(guān)性研究的結(jié)果有差異。因此，我們將本研究數(shù)據(jù)與Sun等報道的FasL基因啟動子區(qū)-844T/ C SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。除對照組等位基因分布在兩個研究中無差異以外，其余分布均存在差異。我們認(rèn)為，第一，兩個研究中研究的地區(qū)不一樣，人的基因型可能有所差異。有研究顯示，不同地區(qū)，不同種族FasL-844 T/C SNP有所差異。第二，我國南北方食管鱗癌的發(fā)病因素可能有所差異。第三，F(xiàn)asL-844 CC基因型人群的淋巴細(xì)胞的FasL表達(dá)較高，同時，有研究顯示正常食管黏膜細(xì)胞也有FasL表達(dá)，這些可能是對食管鱗癌的保護(hù)性屏障。正常機(jī)體較高的FasL表達(dá)水平可能對食管的細(xì)胞轉(zhuǎn)化有防御作用。

本研究結(jié)果顯示FasL-844 CC基因型是食管鱗癌易感性的保護(hù)性因素，C等位基因也是食管鱗癌易感性的保護(hù)性因素，在浙江地區(qū)人群中FasL基因-844T/C SNP可能與食管鱗癌的易感性有關(guān)。

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FasL gene-844T/C mutation in relation to susceptibility of esophageal cancer in Zhejiang Province

Objective To explore the relationship between FasL gene-844T/C single nucleotide polymorphism（SNP）in promoter and susceptibility of esophageal cancer in Zhejiang Province． Methods The clinical data of 248 patients with esophageal squamous cell carcinoma admitted in Zhejiang Cancer Hospital from January 2008 to October 2011 were collected and 297 healthy individuals were selected as normal controls．Genomic DNA was extracted from peripheral whole blood．PCR-RFLP technique was carried out to detect FasL-844T/C SNP．χ2test and logistic regression was carried out for analysis．Results There was significant difference in genotypes of FasL gene promoter-844 locus between patients and controls(P＜0．05)．CC genotype significantly reduced the prevalence of esophageal squamous cell carcinoma risk(adjusted OR=0．425,95% CI 0．255～0．708,P＜0．01)．Compared to T allele,C allele significantly reduced the prevalence of esophageal squamous cell carcinoma risk（adjusted OR=0．597,95%CI 0．460～0．776,P＜0．01）．Conclusion FasL gene-844T/C SNP is associated with the occurrence of esophageal squamous cell carcinoma in population of Zhejiang Province．

FasL gene SNP Esophageal cancer

2013-02-20）

（本文編輯：楊麗）

2013年浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？蒲谢?，2012年浙江省自然科學(xué)基金（LQ12H16001）

310053 杭州，浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部（王黎芳，伊媛琪）；浙江省腫瘤醫(yī)院胸外科（趙宏光）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（李昕）

趙宏光，E-mail：zhaohg75@126.com