★ 熊瑛 雷玲 張吉翔 (南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 南昌330006)

DNA 能經(jīng)歷不同的修飾，包括鏈斷裂、堿基損傷、解旋核以及內(nèi)源性或外源性鏈交聯(lián)(前者由于活性氧化物，后者為紫外線照射)。為維持基因組的完整性及避免基因損害帶來的負(fù)面影響，細(xì)胞具備一些化學(xué)性及遺傳性的DNA 修復(fù)途徑。損傷的DNA 如果無法修復(fù)，將會(huì)為人類帶來一系列的機(jī)能紊亂，如發(fā)育缺陷、神經(jīng)畸形、光過敏、癌癥以及加速老化過程。核苷酸剪切修復(fù)是最重要的DNA 修復(fù)系統(tǒng)之一，它對(duì)消除由于抗致瘤藥物以及紫外線照射所引起的某些DNA 損傷起著關(guān)鍵作用，比如環(huán)丁烷嘧啶(CPD)和嘧啶(6 －4)嘧啶酮產(chǎn)物(它們會(huì)破壞DNA 的螺旋結(jié)構(gòu))。核苷酸剪切修復(fù)障礙會(huì)導(dǎo)致一些少見的常染色體顯性遺傳疾病，如著色性干皮病、cockayne 綜合癥以及毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙。11 種基因的突變與這些疾病相關(guān)。參與核苷酸剪切修復(fù)基因產(chǎn)物，和這11 個(gè)基因中的三種(XPB，XPD and p8/TTDA)，是組成轉(zhuǎn)錄/修復(fù)因子TFIIH 的基礎(chǔ)部分［1］。今天，我們將詳細(xì)闡述TFIIH 的分子功能及檢測(cè)其功能損傷將導(dǎo)致毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙。

1 毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙遺傳學(xué)特點(diǎn)

遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)揭示了光過敏毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙患者是由于TFIIH 十個(gè)亞基中的三個(gè)，即XPD、XPB和p8/TTDA 突變所導(dǎo)致的。甚至在從毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙患者中提取的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，TFIIH 的細(xì)胞濃縮物也大大減少了。但是，無論是DNA 修復(fù)缺失的程度還是TFIIH 水平下降的程度都與臨床表現(xiàn)型的程度無明顯正相關(guān)。著色性干皮病患者的細(xì)胞中TFIIH 水平也顯著下降。大部分光過敏毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)不良病例中，XPD 基因出現(xiàn)變異，其變異位置位于蛋白質(zhì)末段的C 端或位于R112 環(huán)［2］。在這里必須指出，在部分病例中，相同的變異可導(dǎo)致不同的臨床表現(xiàn)型，但是表型的嚴(yán)重程度則取決于等位基因的突變特性，這就告訴我們，等位基因可能促成了毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙的臨床表現(xiàn)型［3］。流行病學(xué)研究顯示XPD 中p. H201Y，p. D312N 和p. K751Q 的多態(tài)性可能與肺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌相關(guān)，但與類毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙癥狀無關(guān)。在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡述了在體外包含XPD 多態(tài)性的TFIIH 復(fù)合物中存在正常的DNA 修復(fù)和基本轉(zhuǎn)錄。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明XPD 的單一多態(tài)性是良性改變，而不同多態(tài)性的復(fù)合體則有腫瘤化傾向［4］。在XPB 中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)突變，其中只有T119P 突變會(huì)導(dǎo)致毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙。p8/TTDA 是TFIIH 的第10 個(gè)亞基，它與光過敏毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙的第三種類型相關(guān)。p8/TTDA 的突變，無論是L21P，R56 終止還是堿基T、C 之間的轉(zhuǎn)變(在起始密碼子)都將導(dǎo)致p8/TTDA 蛋白缺失［5］。TTDN1 被鑒定為非光過敏毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙的第一個(gè)致病基因。在44 例非光過敏患者中只有6 例出現(xiàn)了基因突變。TTDN1 的堿基切除修復(fù)能力正常，其TFIIH 也在保持正常穩(wěn)定水平［6］。臨床表型的嚴(yán)重性與TTDN1 的突變無關(guān)，這說明非光過敏毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙是多因子疾病，除了TTDN1 突變外的其他因素可能影響了該病表型。事實(shí)上，TTDN1 與polo－like 激酶1 相互作用通過Cdk1 的磷酸化在調(diào)節(jié)有絲分裂和胞質(zhì)分裂中起作用［7］。

2 核苷酸剪切修復(fù)中的TFIIH 在毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙中的作用

核苷酸剪切修復(fù)是一個(gè)至少需要2 個(gè)旁路的多步驟過程。一個(gè)是配對(duì)轉(zhuǎn)錄DNA 修復(fù)，一個(gè)是總體基因組修復(fù)，前者只在轉(zhuǎn)錄活化的DNA 鏈上清除損傷，后者則作用于基因組的任何序列。在真核細(xì)胞中，這個(gè)過程需要超過30 種蛋白用于可連續(xù)作用于損傷DNA 的蛋白:識(shí)別DNA 損傷、打開損傷DNA鏈、切開單鏈病清除損傷的DNA 片段、修補(bǔ)并連接DNA 復(fù)合物。人類TFIIH 核心部分為一個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，由七個(gè)亞基組成:XPB、XPD、p62、p52、p44、p34和p8/TTDA，它與CDK 活化激酶(由Cdk7，cyclin H 以及MAT1 組成)相關(guān)。無論這個(gè)部位的損傷DNA 修補(bǔ)時(shí)通過XPC/HR23B 還是RNA 聚合酶II，TFIIH 都會(huì)通過募集XPG 及XPF 內(nèi)源性核酸酶打開損傷DNA 鏈并加速損傷剪切清除。為使得DNA囊泡化，TFIIH 核心部分啟動(dòng)2 個(gè)具三磷酸水解功能的解螺旋酶蛋白，同時(shí)CAK 從核心部分釋放至XPA 與其他核苷酸剪切修復(fù)因子附近［8］。雖然CAK 激酶活性通過RNA 聚合酶II 最大亞基的C 端和大量細(xì)胞核受體的磷酸化在基本轉(zhuǎn)錄過程中十分關(guān)鍵，但它對(duì)核苷酸剪切修復(fù)則不是必需的。

2.1 XPB 基因在毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙中的作用

DNA 在損傷附近打開可能是通過XPB 的解螺旋酶活性驅(qū)動(dòng)。近年來研究表明XPB 的解螺旋酶活性在核苷酸剪切修復(fù)中非關(guān)鍵因素。但是XPB的三磷酸腺苷酶活性在與XPD 解螺旋酶活性連接是清除DNA 損害所必需的。XPB 除了其7 個(gè)解螺旋酶基序中有1 個(gè)是三磷酸腺苷連接位點(diǎn)，還占據(jù)2 個(gè)額外的三磷酸腺苷激酶基序:保守R －E －D 殘余環(huán)基序(氨基酸472 －474)和正電荷拇指(ThM)區(qū)域(氨基酸514 －537)。這些基序在XPB 的依賴DNA 三磷酸腺苷酶活性調(diào)節(jié)方面是具備特異性的，有助于TFIIH 與損傷DNA 的連接，并允許其他核苷酸剪切修復(fù)因子參與?？v使位于其他解螺旋酶/三磷酸腺苷激酶外的XPB/T119P 變異將擾亂TFIIH結(jié)構(gòu)［9］。TFIIH 的另一個(gè)亞基P52 與XPB 相互作用，刺激其ATP 激酶活性。P52 的變異(Dmp52)，降低與XPB 相互作用的穩(wěn)定性，將導(dǎo)致對(duì)紫外線敏感性大大增加、癌變傾向、毛發(fā)變脆、角質(zhì)畸形和發(fā)育性缺陷［10］。P52 的突變可能破壞其與XPB 或其他DNA 修復(fù)轉(zhuǎn)錄因子在形態(tài)與功能上的相互作用。如果發(fā)生在人類的此類突變所致臨床表型，我們稱之為毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙和著色性干皮病。

2.2 XPD 基因在毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙中的作用

除XPB 外，TFIIH 包含了另一個(gè)DNA 解螺旋酶亞基XPD，它在核苷酸剪切修復(fù)過程中打開損傷附近的DNA 有至關(guān)重要的作用，而對(duì)轉(zhuǎn)錄起始則作用不大。最近對(duì)于XPD 結(jié)構(gòu)研究顯示，其包含了2 個(gè)規(guī)范解螺旋酶片段(HD1:解螺旋酶基序I，Ia，II，III;HD2:解螺旋酶基序IV，V ，VI)的1 個(gè)4 區(qū)域機(jī)構(gòu)，鐵硫簇連接和弓形片段。但是，XPD 結(jié)構(gòu)部位的變異與毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙的臨床表型無關(guān)。廣泛分布在4 個(gè)片段的毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙變異可能會(huì)干擾不同TFIIH 亞基(這些亞基能影響TFIIH 復(fù)合物完整性)的相互作用［11］。盡管著色性干皮病患者的癌癥發(fā)生率升高是由于核苷酸剪切修復(fù)障礙，但是不知道為何光過敏毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙沒有惡變傾向。答案可能就來源于免疫細(xì)胞化學(xué)的研究。在紫外線照射后，在完成大部分損傷DNA 修復(fù)后，核苷酸剪切修復(fù)因子會(huì)立即匯集在損傷位點(diǎn)并在整個(gè)細(xì)胞核內(nèi)重新分布。損傷識(shí)別蛋白XPC 迅速集中在著色性干皮病和毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙病患細(xì)胞中(在野生型細(xì)胞中亦然)。但是在著色性干皮病細(xì)胞中，XPC 將會(huì)在紫外線照射后24 小時(shí)后重新分配并因殘留延遲募集TFIIH 復(fù)合物至損傷位點(diǎn)，而在毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙細(xì)胞中，XPC 在3 小時(shí)就進(jìn)行重新分配至損傷位點(diǎn)同時(shí)很難募集TFIIH 至DNA 損傷部位［12］。這些結(jié)果部分支持了假設(shè):雖然著色性干皮病和毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙都是由于核苷酸剪切修復(fù)缺陷導(dǎo)致，在毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙中損傷位點(diǎn)核苷酸剪切修復(fù)復(fù)合物缺失，可能使得合成物反式損傷或復(fù)制后修復(fù);而在著色性干皮病中，在不匹配位點(diǎn)出現(xiàn)的核苷酸剪切修復(fù)因子殘留可能阻止了復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄過程，將導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性及癌癥發(fā)生率上升。XPB/p52、XPD 與P44 相互作用、TFIIH 的另一個(gè)亞基及其聯(lián)合都會(huì)上調(diào)XPD 解螺旋酶活性而不是其三磷酸腺苷酶活性。大部分XPD 變異都位于其C 端并減弱其N 端與P44 的相互作用，這就是為何這些病人會(huì)出現(xiàn)核苷酸剪切修復(fù)。P44 像典型的泛素連接酶E3(P34 亞基也一樣)具備一個(gè)指環(huán)片段，而Ssl1p(P44 同源芽酵母)顯示出可影響轉(zhuǎn)錄的泛素連接酶E3 活性［13］。

2.3 p8/TTDA 在毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙中的作用

p8/TTDA 是TFIIH 復(fù)合物中第10 個(gè)且是最小的亞基，其突變只導(dǎo)致毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙。P52 能上調(diào)XPB 活性，p8/TTDA 在體外通過直接與P52 作用從而刺激XPB 的三磷酸腺苷酶活性［5］。XPB、P52和p8/TTDA 這三個(gè)亞基的相互聯(lián)系作用已被大量遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。事實(shí)上，p8/TTDA 的過表達(dá)不僅在TTD － A 細(xì)胞、XPD 變異的TTD 細(xì)胞以及Dmp52(人類P52 同源體)變異的果蠅屬細(xì)胞中都能重建TFIIH 正常水平［14］。這些實(shí)驗(yàn)都強(qiáng)調(diào)了P8作為TFIIH 穩(wěn)定劑的作用，2 個(gè)孤立動(dòng)態(tài)的p8/TTDA 池存在:一個(gè)與TFIIH 連接而另一個(gè)則是往返于胞漿和胞核的備用插入單元。溶液結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)顯示后一種形式就像一個(gè)同型二聚體。誘導(dǎo)DNA 損傷后，這兩種p8/TTDA 池的平衡被打破，它們迅速替換成為TFIIH 復(fù)合物中一個(gè)更加穩(wěn)定形式。結(jié)構(gòu)研究顯示p8/TTDA L21P 突變可能破壞其組成。甚至，R56終止子突變減弱了p8/TTD－A 與p52 的相互作用，最終將導(dǎo)致TFIIH 穩(wěn)定性下降［15］。還有很多潛在的修飾TFIIH 復(fù)合物功能的途徑，因而分析TFIIH各亞基的作用仍需進(jìn)行大量的研究。分析翻譯修飾后蛋白對(duì)大多數(shù)細(xì)胞周期、TFIIH 所經(jīng)歷的修飾途徑以及這些修飾途徑如何調(diào)節(jié)復(fù)合物活性具有重大意義，這些對(duì)于我們了解毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙臨床表型的分子基礎(chǔ)有幫助:泛素蛋白酶體下調(diào)DNA 修復(fù)調(diào)節(jié)途徑;XPB 與26S 蛋白酶體亞基SUG1 相互作用;MAT1 蛋白化作用調(diào)節(jié)CAK 活性;其他轉(zhuǎn)錄后修飾如XPB 磷酸化，通過阻止XPF－ERCC1 核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的切開步驟，從而調(diào)節(jié)核苷酸剪切修復(fù)［16］。除了上述研究，揭示TFIIH 各亞基功能及修飾作用仍需進(jìn)一步進(jìn)行探討。

3 毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙與轉(zhuǎn)錄綜合征

DNA 修復(fù)缺陷將導(dǎo)致毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙、著色性干皮病、科凱恩氏綜合征、血液病、沃納綜合癥、Nijmegen 斷裂綜合征、細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)綜合征等等疾病［1］。缺失DNA 修復(fù)甚至與神經(jīng)障礙有關(guān)，核苷酸剪切修復(fù)活性在終末分化神經(jīng)元中顯著下降，這說明缺失DNA 修復(fù)經(jīng)典模式下的神經(jīng)退行性變促成DNA 損傷蓄積直至神經(jīng)死亡。但是紫外線能深入穿透皮膚真皮而無法進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙病人相較神經(jīng)退行性變更受發(fā)育性缺陷的痛苦(如髓鞘形成障礙)，說明毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙臨床表型是由于轉(zhuǎn)錄缺陷引起。有研究表明核苷酸剪切修復(fù)因子與編碼基因的轉(zhuǎn)錄蛋白相關(guān)。在毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙患者細(xì)胞中找到XPD 突變的TFIIH，而著色性干皮病患者則無這一突變，顯示其體外基本轉(zhuǎn)錄缺失。然而，毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙和著色性干皮病的成纖維細(xì)胞微陣列基因表達(dá)分析表明無顯著性差異。毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙的癥狀主要是由于在分化細(xì)胞和特定組織中的轉(zhuǎn)錄存在明顯差異的發(fā)育障礙引起的［17］。最近一項(xiàng)毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙小鼠模型研究中提出在毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙發(fā)病機(jī)制中TFIIH 的輔激活因子相當(dāng)重要。攜帶了人類患者中的一個(gè)突變基因TTD/Xpd (R722W)突變體小鼠出現(xiàn)了相似的臨床表型，如小腦畸形及硫化髓鞘形成，這些缺陷都是由于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中甲狀腺激素靶基因反常所導(dǎo)致的［18］。事實(shí)上，包含R722W 突變的TFIIH無法正確穩(wěn)定甲狀腺激素受體至其連接位點(diǎn)，導(dǎo)致該受體轉(zhuǎn)錄缺陷。XPD 其他突變減弱CAK 靶定至TFIIH 核心，其磷酸化PPARs，RARa 和/或VDR 配偶體能力下降，而激素敏感基因的高效表達(dá)必須經(jīng)過磷酸化過程。初期光過敏與核苷酸剪切修復(fù)缺失相關(guān)，但是其他毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙患者光敏感癥狀原因則是非常復(fù)雜的。除了TFIIH 變異及與之相關(guān)核苷酸剪切修復(fù)匱乏，近年來研究表明TTDN1 基因與非光過敏毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙有關(guān)，該基因調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂及胞質(zhì)分裂，而無其他機(jī)制與毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙臨床表型相關(guān)［19］。從光過敏和非光過敏毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙細(xì)胞的深入研究可能可以提供為毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng)障礙病理生理學(xué)研究提供新的線索，并揭開萬能TFIIH 復(fù)合物朦朧而美麗的面紗。

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