李奇 趙奎君 趙艷玲 王伽伯 方芳 呂旸 馬致潔 蔣冰倩 浦仕彪 鄒正升 滕光菊 宮嫚 肖小河

何首烏始載于《開寶本草》，為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb .的干燥塊根。味苦、甘、澀，微溫，歸肝、心、腎經(jīng)，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便等功效；制何首烏為何首烏的炮制加工品，二者歸經(jīng)性味相同，具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨、化濁降脂等功效[1]。何首烏與人參、靈芝、冬蟲夏草歷來并稱為中國“四大仙草”，古今皆為醫(yī)家、飲食家所推崇，成為滋補延年之佳品。臨床中常用于治療肝、腎精血虧虛所致的頭昏目眩、須發(fā)早白、腰膝酸軟及遺精等，近年來用于高血壓、高血脂、冠心病、斑禿、脫發(fā)等證的治療，療效滿意。但是近年來國內(nèi)外關(guān)于何首烏肝毒性的報道屢見不鮮[2-9]：如英國、澳大利亞、荷蘭、意大利、哥倫比亞、韓國和中國香港等相繼出現(xiàn)何首烏肝損害的病例報道，癥狀分別表現(xiàn)為輕重度黃疸、急慢性肝炎、肝功能異常等，因而引發(fā)了國內(nèi)外學者對何首烏用藥安全性問題的高度關(guān)注[10]。

然而，有關(guān)何首烏毒性的實驗研究結(jié)果各不相同且多有矛盾[11-20]，何首烏肝毒性的客觀真實性仍未闡明，難以正確評價何首烏臨床用藥的安全性。本文通過兩部分實驗評價何首烏生品和炮制品的不同提取物的毒性作用：首先是比較不同提取物，找到毒性較大的提取物；然后，針對毒性較大的提取物，以CCl4作為陽性對照，進一步評價何首烏對大鼠主要臟器的損傷情況，并考察其組織病理損傷與血生化指標的相關(guān)性。為了盡可能暴露出何首烏潛在的毒性，本文在較大劑量下考察了何首烏損傷肝臟等臟器的可能性。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

生何首烏(批號：10050904)購于北京綠野藥業(yè)有限公司，經(jīng)解放軍第三〇二醫(yī)院肖小河研究員鑒定為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥塊根。制何首烏(批號：10122402)由上述同一批生何首烏炮制而成，炮制方法參照《中華人民共和國藥典(2010年版)》及《北京市中藥材炮制規(guī)范》，由北京綠野藥業(yè)有限公司協(xié)助完成。

SD大鼠，SPF級，體重160 g左右，雄性，共132只，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(合格證號SCXK-軍2007-004)。動物飼養(yǎng)于屏障動物房，室溫(20±2)℃,相對濕度60%～70%,通風良好、環(huán)境安靜,室內(nèi)保持12小時照明,12小時黑暗,并定期消毒。

2500型超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司),邁瑞B(yǎng)S-300全自動生化分析儀(上海富眾生物科學有限公司)。

1.2藥品制備

本實驗醇提物所采取的提取方法為：將生何首烏和制何首烏分別粉碎得粗粉，加6倍量的75%乙醇冷浸提取，共提取5次，每次48小時，合并醇浸提取液，濃縮并減壓干燥，制得干粉備用。水提物所采取的提取方法為：將生何首烏和制何首烏分別粉碎得粗粉，加10倍量的蒸餾水煎煮1.5小時，回流提取2次，合并提取液，濃縮并減壓干燥，制得干粉備用。藥材粉碎通過200目篩即得藥材全粉。每次給藥前按生藥量配制藥液，水浴加熱至37 ℃時使用。

1.3何首烏不同提取物的毒性比較試驗

將實驗動物SD大鼠隨機分為7組，生何首烏醇提物、制何首烏醇提物、生何首烏水提物、制何首烏水提物、生何首烏全粉、制何首烏全粉和正常對照組，每組12只，均為雄性。各給藥組劑量均為20 g/kg。按4 ml/200 g體重灌胃給藥，正常對照組給相同量蒸餾水,連續(xù)給藥28小時。給藥期間動物自由飲食。每日觀察給藥前后各組每只動物的外觀體征,行為活動,毛發(fā)變化、大小便形狀、顏色及有無異常分泌物等。每7天大鼠眼眶取血,分離血清,檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)等生化指標的變化，動物股動脈取血后處死,進行全面系統(tǒng)尸檢,對、肝、肺、腎、脾等臟器進行肉眼觀察,記錄有異常的臟器。

1.4何首烏醇浸提物的亞急性毒性試驗

將實驗動物SD大鼠隨機分為4組,分別為正常對照組(Control),陽性對照組(CCl4)，生何首烏組(Crude Polygonum multiflorum，CP)、制何首烏組 (Prepared Polynonum multiflorum, PP),每組12只,均為雄性。各給藥組劑量均為40 g/kg。按4 ml/200 g體重灌胃給藥, 對照組給相同量蒸餾水, 陽性對照組按1.25 ml/kg CCl4腹腔注射(每周3次)，連續(xù)給藥28天(4周)。給藥期間動物自由飲食。每日觀察給藥前后各劑量組每只動物的外觀體征,行為活動,毛發(fā)變化、大小便形狀、顏色及有無異常分泌物等。分別在給藥0、7、14、28天稱動物體重,計算體重增長率。給藥期間每7天大鼠眼眶取血,分離血清,全自動生化儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素(UREA)、谷氨?；D(zhuǎn)移酶(γ-GT)、肌酐(CREA)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、結(jié)合膽紅素(DBIL)、磷酸肌酸激酶(CK)指標變化。動物股動脈取血后處死, 進行全面系統(tǒng)尸檢,對肝、肺、腎、脾、性腺、甲狀腺、胸腺、回腸等進行肉眼觀察,記錄有異常的臟器,稱重并計算臟器系數(shù)。尸檢后取肝、腎、肺組織進行組織病理檢測。

1.5組織病理檢測

用10%中性甲醛溶液固定,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚4～5 μm)、HE染色。在光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.6統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1何首烏不同提取物的毒性差異

初步實驗結(jié)果表明：生何首烏和制何首烏的醇提物均可使大鼠行為活動減少，毛色發(fā)黃并出現(xiàn)便溏現(xiàn)象。尸檢后肉眼觀察：生何首烏醇提物組(6/12)、制何首烏醇提物組(4/12)均出現(xiàn)肝臟腫大、變色、纖維化等病變特征，但ALT和AST無顯著性變化。生何首烏水提物組(3/12)和制何首烏水提物組(1/12)也出現(xiàn)行為活動減少、毛色發(fā)黃等現(xiàn)象，但是發(fā)現(xiàn)肝臟僅輕微腫大，無其他明顯病變特征。生何首烏全粉組和制何首烏全粉組無明顯異?，F(xiàn)象。

2.2何首烏醇提物對大鼠的臟器毒性

2.2.1 對大鼠體重和臟器指數(shù)的影響 各給藥組動物均出現(xiàn)活動減少、皮膚毛色變黃、便溏且呈灰白色等現(xiàn)象。根據(jù)圖1可知：各給藥組大鼠體重增長均受到不同程度的抑制作用，生何首烏組大鼠增長趨勢明顯緩慢(P>0.05)且受到抑制，但在實驗第4周時顯示出抑制作用減弱的態(tài)勢，大鼠體重顯著性增長(P<0.05)；制何首烏和CCl4陽性藥對大鼠體重增長也存在明顯的抑制作用，但較生何首烏為輕。結(jié)果表明，何首烏可抑制大鼠體重增長，其中生何首烏比制何首烏嚴重。

注：Control：正常對照組；CCl4：肝損傷陽性對照組；CP：生何首烏組；

PP：制何首烏組。與正常對照組相比，aP<0.05;bP<0.01

圖1 各組大鼠的體重增長動態(tài)變化

臟器指數(shù)可一定程度反映實驗大鼠與正常大鼠臟器之間的差異，對于臟器損害程度監(jiān)測具有一定的指導意義。根據(jù)圖2可知：生何首烏和CCl4陽性藥可使大鼠肝臟和腎臟一定程度腫大，肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)；而且生何首烏還可使大鼠肺臟一定程度腫大，肺臟指數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)。結(jié)果提示：生何首烏可導致大鼠肝臟、腎臟和肺臟腫大及病變。

注：Control：正常對照組；CCl4：肝損傷陽性對照組；CP：生何首烏組；

2.2.2 對大鼠肝腎功能指標的影響 課題組對各項生化指標實行動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：結(jié)合DBIL、ALB、CREA、ALP和CK這5項指標給藥后7天、14天、21天均沒有顯著性變化，而在給藥28天后發(fā)生顯著性改變；ALT和AST這兩項指標給藥后7天、14天、21天、28天后均無顯著性差異，但是于給藥第3天后ALT和AST曾經(jīng)出現(xiàn)一過性顯著升高。根據(jù)圖3可知，在整個實驗周期中，生何首烏組大鼠的ALT和AST除第3天出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)之外，其他各檢測時間點均無顯著性差異,制何首烏組也無顯著性改變。根據(jù)圖4可知，生何首烏組大鼠的DBIL和ALP顯著升高，CREA和ALB顯著降低；制何首烏組大鼠ALB、CREA和CK顯著降低。從具有顯著性差異的生化指標來看，生何首烏比制何首烏差異程度大，可一定程度反映生何首烏的毒性作用大于制何首烏。

2.2.3 對大鼠肝組織的影響 生何首烏組有2例(2/12)死亡，1例(1/12)肝組織中度損傷，4例(4/12)肝組織輕度損傷；制何首烏組有1例(1/12)死亡，7例(7/12)肝組織輕度損傷。四氯化碳模型組有3例(3/12)死亡，2例(2/12)肝組織中度損傷，3例(3/12)肝組織輕度損傷；正常對照組無損傷及死亡現(xiàn)象。根據(jù)圖5可以看出，與正常對照大鼠比較，生何首烏組大鼠肝臟組織可見灶性肝細胞壞死，肝細胞索排列紊亂，灶性肝細胞嗜酸性變，水腫顆粒樣變性，及肝細胞胞漿中可見部分脂滴等病變現(xiàn)象。制何首烏組可見肝細胞濁腫，肝細胞索排列較紊亂，肝血竇較狹窄及局部肝細胞嗜酸性變等病變現(xiàn)象。CCl4陽性對照組可見肝小葉周圍肝細胞廣泛脂肪變性，肝細胞呈星點狀腫大及胞漿透明且有大脂滴等病變特征。

注：Control：正常對照組；CCl4：肝損傷陽性對照組；CP：生何首烏組；

圖3 各組大鼠的ALT和AST動態(tài)水平變化

注：Control：正常對照組；CCl4：肝損傷陽性對照組；CP：生何首烏組；

2.2.4 對大鼠腎組織的影響 生何首烏組出現(xiàn)5例(5/12)腎組織輕度損傷；制何首烏出現(xiàn)1例(1/12)腎組織中度損傷，5例(5/12)腎組織輕度損傷。根據(jù)圖6可以看出，與正常對照大鼠比較，生何首烏組大鼠可見腎小管上皮細胞水腫顆粒樣變性，腎小球體積增大且毛細血管腔內(nèi)紅細胞淤積，包曼氏囊腔狹窄并伴系膜細胞及基質(zhì)增生，伴有毛細血管腔開放欠佳等病變特征。制何首烏組可見腎小管上皮細胞輕度水腫顆粒樣變性，腎小球體積增大且系膜區(qū)輕至中度增寬伴系膜細胞及基質(zhì)增生，局部毛細血管開放欠佳等病變特征。CCl4陽性對照組可見腎小管上皮細胞輕度水腫顆粒樣變性，局部腎小球系膜基質(zhì)節(jié)段性輕度增多，腎小球毛細血管腔內(nèi)紅細胞輕度淤積等病變特征。

2.2.5 對大鼠肺組織的影響 生何首烏組出現(xiàn)3例(3/12)肺組織中度損傷，4例(4/12)肺組織輕度損傷；制何首烏組出現(xiàn)2例(2/12)肺組織中度損傷，5例(5/12)肺組織輕度損傷。根據(jù)圖7可以看出， 與正常對照大鼠比較， 生何首烏組大鼠可見局部肺泡壁間隔重度增寬伴單個核炎細胞浸潤及纖維組織增生等病變特征。制何首烏組可見肺泡壁較廣泛增寬伴單個核炎細胞浸潤及纖維組織增生等病變特征。CCl4陽性對照組可見肺泡壁間隔明顯增寬，間隔內(nèi)較多單個核炎細胞浸潤，毛細血管腔內(nèi)紅細胞淤積等病變特征。

注：Control：正常對照組；CCl4：肝損傷陽性對照組；CP：生何首烏組； PP：制何首烏組

注：Control：正常對照組；CCl4：肝損傷陽性對照組；CP：生何首烏組； PP：制何首烏組

注：Control：正常對照組；CCl4：肝損傷陽性對照組；CP：生何首烏組； PP：制何首烏組

3 討論

何首烏(生品和制品)不同提取物的毒性比較實驗表明，醇提物的毒性比水提物和藥材全粉的毒性大，提示何首烏的肝毒性物質(zhì)可能集中在醇提物中。根據(jù)相似相溶的原理，醇提物比水提物含有較多的極性較弱蒽醌類成分，魯彥等[21]也認為蒽醌主要存在于醇提物中。白研等[22]認為何首烏中蒽醌類成分主要含有大黃素和大黃酚。美國國家衛(wèi)生研究院的研究表明，大黃素可引起F344/N大鼠和B6C3F1小鼠腎小管損傷及肝細胞病變[23]。孫向紅等[24]研究發(fā)現(xiàn)大黃素和大黃酸是何首烏引發(fā)肝毒性的主要成分，高濃度長時間下具有細胞毒作用。張瑞晨等[27]研究發(fā)現(xiàn)，何首烏95%乙醇洗脫物是其引起肝損傷的主要物質(zhì)，而大黃素是導致肝細胞損傷的成分之一。綜合來看，何首烏所含蒽醌類成分可能是其重要的肝毒性成分之一，同時也提示服用何首烏藥酒應該保持一定的警惕性。

進一步對何首烏醇提物的亞急性毒性實驗表明，大劑量何首烏醇提物的毒性作用體現(xiàn)在多個方面，包括對體重增長的抑制作用、臟器指數(shù)異常、DBIL、ALB、CREA、ALP和CK等多項肝腎功能生化指標的顯著改變，以及引起多個臟器(肝臟、腎臟和肺臟)的病理改變。特別值得一提的是，何首烏對大鼠臟器的損傷作用不只限于肝臟，對肺臟和腎臟同樣有損害，其中何首烏的肺損傷作用為首次報道。何首烏與大黃屬于同科植物，二者均含蒽醌類成分，文獻報道大黃蒽醌成分可引起腎損傷[25]，推測何首烏引發(fā)腎臟損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)可能也是蒽醌類成分。何首烏對肺臟有損傷作用，而大黃未發(fā)現(xiàn)有肺損傷報道，提示何首烏損傷肺臟的物質(zhì)可能與其所含特異性成分有關(guān)。

何首烏引發(fā)肝損傷的過程中，ALT和AST這兩項臨床常用的藥物肝損害檢測指標，除在第3天(生首烏組)曾經(jīng)出現(xiàn)一過性顯著升高外，在整個實驗周期內(nèi)均無顯著性變化，而從動物的一般表現(xiàn)和病理改變來看，何首烏(生品和制品)確實有肝臟損傷的作用。CCl4陽性對照組給藥第一周即引起ALT、AST顯著升高，其機制是·CCl3自由基導致細胞膜脂質(zhì)過氧化，從而使肝細胞膜受到破壞、通透性發(fā)生改變，致使肝臟細胞中ALT和AST等酶漏出[26]，因而ALT和AST對CCl4引起肝臟損傷較為敏感。由于何首烏與CCl4對ALT和AST的影響規(guī)律不同，推測何首烏的肝損傷機制與CCl4不同。張瑞晨等[27]認為何首烏醇提物對人正常肝細胞L02周期阻滯從而引起凋亡。在肝細胞凋亡的早期，不一定會引起血ALT和AST顯著升高。王濤等[28]報道了何首烏水提物也未引起血ALT和AST顯著升高。綜合來看，血清酶(ALT和AST)對何首烏早期肝損傷不敏感，難以早期有效預警中藥何首烏對肝臟損傷的發(fā)生。

從生何首烏和制何首烏對比考察結(jié)果來看，制何首烏的毒性作用顯著低于生何首烏，與傳統(tǒng)及文獻報道炮制減毒的認識相同[29]。從文獻報道[30]及筆者相關(guān)研究來看，何首烏炮制品的質(zhì)量參差不齊，相當數(shù)量的炮制品可能未達到足夠的炮制時間或簡化了炮制方法[31]，難以達到炮制減毒的目的，可能是導致臨床毒副反應發(fā)生的重要因素之一[32]。而目前藥典檢測含量控制指標和標準難以反映炮制程度。因此，筆者認為亟待增加反映炮制減毒程度的控制指標，加強制何首烏減毒的控制，保障臨床用藥安全。此外，目前生何首烏和制何首烏均為收錄入可用于保健食品的物品名單，考慮到保健食品不限制服用劑量、時間和適應癥，而何首烏(尤其是生何首烏)在大劑量下確可引起肝腎等臟器損害，是否將生何首烏列入可用于保健食品目錄有待系統(tǒng)評價。綜上，建議加強對何首烏毒副反應監(jiān)測，臨床用藥嚴格按照藥典規(guī)定的劑量(生何首烏<6 g/日，制何首烏<12 g/日)，生何首烏長時間用藥應注意監(jiān)測肝腎損害，加強制何首烏炮制減毒控制標準研究。

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