文 / 董雪鳳 楊子彪 任發(fā)政

（1云南大理來(lái)思爾乳業(yè)有限責(zé)任公司；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院）

大腸桿菌群是指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，一般不致病，為人和動(dòng)物腸道中的常居菌，但在一定條件下可引起腸道外感染。人在感染大腸桿菌后的癥狀為胃痛、嘔吐、腹瀉和發(fā)熱，感染可能是致命性的。該菌對(duì)熱的抵抗力較其它腸道桿菌強(qiáng)，在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，是食品污染的主要來(lái)源[1]。

目前，我國(guó)奶牛主要以家庭小規(guī)模飼養(yǎng)為主，牛舍設(shè)施不良，擠奶和收奶過(guò)程不規(guī)范，加之牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富，很容易造成原料奶的污染，被普遍認(rèn)為是致病性大腸桿菌的主要污染來(lái)源[2]。乳酸菌對(duì)大腸桿菌有一定的抑制作用[3]，可以用來(lái)提高乳制品的安全性。另外原料奶中污染大腸桿菌也會(huì)影響酸奶發(fā)酵劑的性能，從而影響發(fā)酵乳的質(zhì)量。本文針對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種對(duì)大腸桿菌的抑制作用和大腸桿菌對(duì)乳酸菌的影響進(jìn)行了研究，為乳酸菌在發(fā)酵乳中的應(yīng)用提供了更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 乳酸菌

保加利亞乳桿菌L5、嗜熱鏈球菌G7，由云南大理來(lái)思爾乳業(yè)提供。

1.1.2 大腸桿菌

從乳品中分離。

1.1.3 試劑

（0.1000±0.0002） mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.5%酚酞指示劑、95%乙醇、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、30 g/mL硼酸溶液、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑、0.0500 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、40%氫氧化鈉溶液、鄰苯二胺、濃鹽酸等，除特殊標(biāo)注的試劑外，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 脫脂奶RSM（12%，W/V）

無(wú)抗生奶加無(wú)抗奶粉脫脂（奶粉添加量為脫脂后固形物含量的12%）， 115 ℃滅菌15min。

1.1.5 M17培養(yǎng)基

酪蛋白胨5 g、聚蛋白胨5 g、植物蛋白胨5 g、酵母浸膏2.5 g、牛肉膏5 g、磷酸甘油10 g、硫酸鎂0.25 g、維生素C 0.5 g、 蒸餾水950 g；pH值7.1～7.2；121 ℃滅菌15 min。

1.1.6 MRS培養(yǎng)基

pH值6.2～6.4，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器和設(shè)備

SNB-1數(shù)字粘度計(jì)、KDY-9830凱氏定氮儀、pH211精密酸度計(jì)、DGF30121電熱鼓風(fēng)干燥箱、LRH-250A生化培養(yǎng)箱、AL204電子天平凈化工作臺(tái)、QL-901混合器、XS-212-201顯微鏡。

1.3 乳酸菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用

1.3.1 瓊脂平板

取樣品10 mL，無(wú)菌條件下1 500 rpm離心10 min，收集上清液。將已滅菌的濾紙片放入上清液中，浸泡10 min后，備用。取100 μL不同濃度大腸桿菌24 h乳糖膽鹽培養(yǎng)物，涂布于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上。然后將帶有乳酸菌上清液的濾紙平整地置于含有不同濃度大腸桿菌的伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，4 ℃擴(kuò)散過(guò)夜，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑大小[4～5]。

1.3.2 RSM培養(yǎng)基

將不同活力的乳酸菌樣品與不同濃度的大腸桿菌同時(shí)接種于RSM培養(yǎng)基中，發(fā)酵不同時(shí)間，取出，分別作大腸桿菌最近似值數(shù)的檢測(cè)[6]。

1.3.3 乳酸菌的活力

取脫脂奶RSM培養(yǎng)基10 mL，將待測(cè)發(fā)酵劑按3%接種量接入脫脂乳中，37.8 ℃恒溫培養(yǎng)3.5 h。取出加入20 mL蒸餾水及2 mL 1%的酒精酚酞指示劑，用0.1 M氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色，30 s不褪色，記錄消耗氫氧化鈉的體積數(shù)，按下式計(jì)算：乳酸菌的活力=0.1 M氫氧化鈉的體積數(shù)×0.009×10×1.0290%。

1.4 大腸桿菌對(duì)乳酸菌的影響

取保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌（1∶1）混合乳酸菌樣品100 mL，按3%的接種量接種于脫脂奶RSM中，并加入1%的大腸桿菌，42 ℃發(fā)酵。凝乳后置于4 ℃冰箱中，24 h后，取出按3%的接種量接種于脫脂奶RSM中，42 ℃發(fā)酵，凝乳后4 ℃貯存。如此反復(fù)，每反復(fù)1 次算1 代，取2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)物與原乳酸菌樣品進(jìn)行對(duì)比。

將2、4、6 代乳酸菌樣品與原樣品分別作乳酸菌加工物性研究，具體指標(biāo)和方法為：

1.4.1 產(chǎn)酸能力的測(cè)定

乳酸菌的產(chǎn)酸能力以單位時(shí)間pH值的變化（ΔpH）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。將原乳酸菌樣品與2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)物以3%的接種量接種到10 mL已滅菌的RSM中，于37 ℃條件下培養(yǎng)。分別使用pH計(jì)在0、1、2、3、4和5 h測(cè)定凝乳的pH值。

1.4.2 產(chǎn)香能力的測(cè)定[7]

將原乳酸菌樣品與2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)物以3%的接種量接種到100 mL已滅菌的RSM中，于37 ℃條件下培養(yǎng)3 h后取出，放置在4 ℃下保存，24 h后測(cè)定酸乳中的聯(lián)乙酰含量。

1.4.3 水解蛋白能力的測(cè)定

將原乳酸菌樣品與2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)物以3%的接種量接種到已滅菌的RSM中，于37 ℃條件下培養(yǎng)。當(dāng)凝乳的pH值下降到4.6時(shí)取出，放置在4 ℃下保存。7 天后測(cè)定酸乳中的可溶性氮。

1.4.4 產(chǎn)粘能力的測(cè)定

將原乳酸菌樣品與2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)物以3%的接種量接種到已滅菌的RSM中，于37 ℃條件下培養(yǎng)。當(dāng)凝乳的pH值下降到4.6時(shí)取出，立即用流水將其溫度降到（30±1）℃，使用粘度計(jì)測(cè)定凝乳的粘度值。

1.4.5 噬菌體檢測(cè)[8]

用雙層平板法，觀察有無(wú)噬菌斑的形成。

表1 乳酸菌抑菌作用結(jié)果

表2 不同發(fā)酵時(shí)間液體培養(yǎng)抑菌試驗(yàn)結(jié)果 單位：CFU/mL

2 結(jié)果與討論

2.1 平板培養(yǎng)抑菌試驗(yàn)

以不同濃度大腸桿菌作指示菌，用不同活力的混合乳酸菌進(jìn)行平板培養(yǎng)的抑菌試驗(yàn)，結(jié)果都有不同程度的抑菌效果，抑菌圈都在1.2～1.8 cm之間，效果更為顯著的是混合乳酸菌，活力為0.84%。大腸桿菌濃度在1∶100的平板抑菌，其抑菌圈均為1.8 cm。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

將不同活力混合乳酸菌試驗(yàn)結(jié)果作比較，發(fā)現(xiàn)混合乳酸菌活力強(qiáng)，抑制作用強(qiáng)。同樣，將相同活力的乳酸菌作抑菌片，放入不同濃度的大腸桿菌平板平皿中，結(jié)果顯示大腸桿菌濃度低的抑制作用強(qiáng)。

2.2 液體培養(yǎng)抑菌試驗(yàn)

取不同活力的混合乳酸菌樣品，按3%的接種量接種于RSM培養(yǎng)基中，分別加入1%、2%、3%的大腸桿菌，在42 ℃條件下發(fā)酵3、6、9、12、15、18、21、24、27 h。依照國(guó)標(biāo)GB 4789.3—94大腸菌群的檢驗(yàn)方法，檢測(cè)液體培養(yǎng)基RSM中大腸菌群的最近似值。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2中可以看出，不同活力的乳酸菌中加入一定數(shù)量的大腸桿菌后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大腸桿菌數(shù)量逐漸減少，最終被抑制；相同活力的乳酸菌中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大腸桿菌，發(fā)酵相同的時(shí)間，大腸桿菌濃度低的，檢測(cè)出的大腸桿菌數(shù)量也少，大腸桿菌濃度高的，檢測(cè)出的大腸桿菌數(shù)量多；不同活力的乳酸菌，發(fā)酵時(shí)間相同，活力高的檢測(cè)出的大腸桿菌數(shù)量少，活力低的乳酸菌檢測(cè)出的大腸桿菌數(shù)量相對(duì)多[9]。

表3 不同代數(shù)產(chǎn)酸能力表（以pH值表示）

表4 菌株的生長(zhǎng)及加工特性

2.3 大腸桿菌對(duì)乳酸菌的影響

取乳酸菌樣品和2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)物，分別作菌種產(chǎn)酸率、生長(zhǎng)能力、產(chǎn)粘能力、水解蛋白能力、產(chǎn)香能力的研究。原乳酸菌和2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)物產(chǎn)酸能力見(jiàn)表3。

從表3中可以看出，相同的起始酸度，同樣的接種量，發(fā)酵相同的時(shí)間，隨著大腸桿菌在乳酸菌中時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌的產(chǎn)酸能力逐漸減弱。

在酸奶生產(chǎn)中，菌種的篩選具有非常重要的意義，扮演著至關(guān)重要的角色。菌種的選擇直接關(guān)系到酸奶的質(zhì)量、粘度、風(fēng)味以及酸奶的多種功能特性。選擇產(chǎn)酸力適中，產(chǎn)香性能高，有適當(dāng)?shù)鞍姿庑缘木?，有利于形成具有良好功能特性的產(chǎn)品。產(chǎn)酸力適中，便于酸奶的凝固，抑制后酸的上升，延長(zhǎng)酸奶的貨架期。產(chǎn)香性能高，可使形成的酸奶具有濃郁的香味，有利于終產(chǎn)品良好風(fēng)味的形成。酸奶中的羰基化合物，主要是聯(lián)乙酰、乙醛等，它們以一定的比例存在，是構(gòu)成酸奶風(fēng)味的基礎(chǔ)物質(zhì)。Bottazzi（1983）的研究表明，聯(lián)乙酰在酸乳中含量在5 mmol/L以下可產(chǎn)生良好的風(fēng)味。發(fā)酵劑分解酪蛋白產(chǎn)生肽和氨基酸，對(duì)酸奶的成熟及風(fēng)味的產(chǎn)生有著重要的作用。因此產(chǎn)酸能力、產(chǎn)粘能力、產(chǎn)香能力、水解蛋白能力、生長(zhǎng)能力為酸奶發(fā)酵劑菌種的重要指標(biāo)。

從表4中可以看出，原乳酸菌經(jīng)大腸桿菌污染后，產(chǎn)香能力從（4.441±0.012）mg/L降到（3.854±0.011）mg/L，產(chǎn)粘能力從（2.89±0.01）pa.s降到（2.89±0.01）pa.s，酸奶硬度也逐漸降低，而水解蛋白能力幾乎不受影響。用雙層平板試驗(yàn)，結(jié)果2～4 代樣品不受噬菌體的感染。

3 結(jié)論

乳酸菌對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制作用，其抑制作用強(qiáng)弱受乳酸菌活力和大腸桿菌濃度影響。乳酸菌活力強(qiáng)，其對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)；大腸桿菌濃度低，乳酸菌對(duì)它的抑制作用也高。

大腸桿菌對(duì)乳酸菌也有一定的影響，隨著大腸桿菌污染乳酸菌時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌的產(chǎn)酸能力、產(chǎn)香能力、產(chǎn)粘能力、硬度都逐漸減弱。

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