劉希華，張麗，邢建宏，梁一池

（1.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004；2.內(nèi)蒙古赤峰市林業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

關(guān)聯(lián)分析在林木改良育種中的作用

劉希華1，張麗2，邢建宏1，梁一池1

（1.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004；2.內(nèi)蒙古赤峰市林業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

林木生長周期長，遺傳背景復(fù)雜等獨(dú)有的特點(diǎn)，影響了遺傳改良的進(jìn)程。作為第三代分子標(biāo)記——SNP具有雙等位性，豐富度高，較低的突變率，易于自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，通過LD作圖，可構(gòu)建高分辨率的遺傳圖譜，在功能基因組研究中有重要的作用，加速林木育種技術(shù)的革新。

分子標(biāo)記；單核苷酸多態(tài)性；連鎖不平衡；關(guān)聯(lián)分析

目前，我國成為全球森林資源增長最快的國家，到2010年全國森林覆蓋率將達(dá)到20％，年均增加森林面積6000多萬畝，人工林面積年均增量占全球年均增量的53.2％，將成為全球森林資源增長最快的國家。因此，急需生產(chǎn)速度快，材性優(yōu)的良種，營造優(yōu)質(zhì)人工林對我國國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展有著重要作用。但是林木生長周期長，必須依靠現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)而縮短育種周期，加速育種進(jìn)程，創(chuàng)造新種質(zhì)，選育新品種，營造優(yōu)質(zhì)人工林，以緩解木材供需矛盾，增加林業(yè)收益。

為了合理經(jīng)營和利用現(xiàn)有的森林資源及加速林木的遺傳改良進(jìn)程，迫切需要對影響森林生產(chǎn)力、適應(yīng)性和抗性的分子遺傳學(xué)機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。隨著人類、擬南芥、水稻和楊樹全基因組測序工作的完成和許多可利用的ESTs數(shù)據(jù)庫的建立，人們把注意力迅速轉(zhuǎn)移到研究自然群體中的個(gè)體間的遺傳變異形式。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）是真核生物中最常見的遺傳變異形式。近年來，隨著模式植物全基因組測序的完成，植物基因組學(xué)的研究已經(jīng)呈現(xiàn)出由簡單質(zhì)量性狀向復(fù)雜的數(shù)量性狀轉(zhuǎn)移的趨勢，特別是大量SNP標(biāo)記的開發(fā)以及生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析方法發(fā)掘植物數(shù)量性狀基因已成為目前國際植物基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。關(guān)聯(lián)分析（association analysis），又稱連鎖不平衡作圖或關(guān)聯(lián)作圖，是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，鑒定某一群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因關(guān)系的分析方法[1]。與連鎖分析相比，關(guān)聯(lián)分析優(yōu)點(diǎn)有三：（1）花費(fèi)的時(shí)間少。一般以現(xiàn)有的自然群體為材料，無需構(gòu)建專門的作圖群體；（2）廣度大?？梢酝瑫r(shí)檢測同一座位的多個(gè)等位基因；（3）精度高?？蛇_(dá)到單基因的水平[1-3]。

本文就SNPs在樹木改良中的作用做詳細(xì)論述，期望對林木遺傳改良提供一些研究基礎(chǔ)。

1 早期選擇與分子標(biāo)記輔助選擇

林木作為多年生木本植物，其生長周期長，遺傳雜合性高，遺傳機(jī)制不明，而且許多重要經(jīng)濟(jì)性狀是屬于多基因控制的數(shù)量性狀，這使得常規(guī)育種手段往往難以滿足不同目的定向培育林木新品種的要求[4]。因此林木遺傳改良計(jì)劃必須從近期和長期兩個(gè)方面對所花費(fèi)的時(shí)間和可能得到的增益加以平衡。林木育種工作者長期以來一直在尋求一種可以縮短育種周期的捷徑，對林木早期選擇日益深入的研究，為育種工作者實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供了有益的幫助。早期選擇一直是育種學(xué)家關(guān)心和感受到棘手的問題之一，長期以來林木早期選擇的精確和可靠程度一直沒有很好解決。借助遺傳圖譜上的分子標(biāo)記進(jìn)行目的性狀的早期選擇潛力很大,將使林木育種項(xiàng)目獲得巨大的效益。通過構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜還可有效地快速定位和克隆目的基因，為有效地進(jìn)行遺傳資源的收集和保存提供科學(xué)依據(jù)[5-7]。

利用分子標(biāo)記跟蹤基因的轉(zhuǎn)移情況，使之與要選擇的基因緊密連鎖，可在早期篩選分離群體中含有目的基因的植株。同時(shí)確定育種材料中是否存在有用的遺傳變異，并采用有效途徑把目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到品種中，是植物育種項(xiàng)目的兩方面工作。利用易于鑒定的遺傳標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇是提高選擇效率并減少育種盲目性的常用手段。近年來發(fā)展起來的分子標(biāo)記輔助選擇（marker—assisted selection，MAS）途徑是通過分析與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記基因來進(jìn)行育種，從而提高育種效率。有效地克服了常規(guī)育種過程中所采用的形態(tài)學(xué)標(biāo)記存在的數(shù)目少、受環(huán)境影響較大，不易直接選擇的不足,而且分子標(biāo)記輔助選擇具有可快速鑒定材料基因型、可進(jìn)行非破壞性的性狀評價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。大量理論研究發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記輔助選擇比以表現(xiàn)型為基礎(chǔ)的選擇更為有效。因此，分子標(biāo)記輔助育種的理論與實(shí)踐成為研究的熱點(diǎn)。

與其他遺傳標(biāo)記相比，可利用的SNP標(biāo)記數(shù)量和分布都具有顯著優(yōu)勢，因此SNP標(biāo)記用于標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種更具潛力[8]。

2 SNPs的特征

根據(jù)SNP所處的位置，可將SNP分為蛋白編碼SNP[9]和非蛋白編碼SNP 2類，前者位于外顯子中，如果它不引起所編碼的氨基酸改變，則稱為同義SNP，否則稱為非同義SNP，后者往往會(huì)影響相應(yīng)蛋白質(zhì)的功能；同義SNP可位于內(nèi)含子區(qū)或基因間區(qū)，都不會(huì)影響到蛋白質(zhì)序列，而位于基因調(diào)節(jié)區(qū)的SNP稱為調(diào)節(jié)SNPs，也稱為基因周邊SNPs，如果它影響到基因的表達(dá)水平，就會(huì)影響到RNA或蛋白質(zhì)的產(chǎn)量從而影響性狀[10]。

自從19世紀(jì)80年代快速測序和高能量基因型分析技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用開展，實(shí)現(xiàn)大樣本、多基因較大規(guī)模的SNPs工作的開展才得以實(shí)現(xiàn)[11]。據(jù)估計(jì)，在人類基因中至少包括1000萬個(gè)常見的SNPs（把SNPs在群體中出現(xiàn)的頻率超過10％的稱為常見SNP）[12]。由于SNPs具有豐富性、穩(wěn)定性、雙等位性以及容易進(jìn)行高通量地基因型分析等優(yōu)點(diǎn)。因此，近年來，在現(xiàn)代分子遺傳學(xué)的研究領(lǐng)域，SNPs正在迅速地替代簡單序列長度多態(tài)性（simple sequence repeats,SSR）或其他標(biāo)記類型而成為第三代分子標(biāo)記。在相關(guān)性分析及作圖過程中，須檢測少數(shù)候選基因上的等位基因，以確定其與哪一表現(xiàn)性狀相關(guān)，或者若要鑒定與某一特定表型相關(guān)的基因區(qū)域，就需要對全基因組進(jìn)行檢測[13]，所需檢測的最少基因座數(shù)取決于不平衡連鎖的程度。已有研究報(bào)道，同一基因組不同區(qū)域上的重組率至少可相差100倍[14]。

群體遺傳學(xué)是研究群體遺傳結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律的一門學(xué)科，其主要的研究工具是DNA分子的多態(tài)性。在玉米中其多態(tài)性較高，有各種可利用的自交系，非常有利于SNP單倍型分析。甚至一個(gè)玉米基因座上，僅從幾百個(gè)堿基對區(qū)域間就可鑒別出一部分SNP單元型。并且這一基因組片段上的SNP基因座是連鎖不平衡的，也就是說，一個(gè)基因座上的等位基因與另一個(gè)基因座上的等位基因不是隨機(jī)分離和組合的?；趩伪缎偷姆治霰然趩蝹€(gè)SNP分析可提供更多的生物學(xué)信息，并且在分析SNP與表型相關(guān)性時(shí)更為有效。近幾十年來，一些栽培作物種質(zhì)的多樣性不斷減少，其結(jié)果使連鎖不平衡性增加，這有利于目的基因座上SNP單元型與表型的相關(guān)性分析。

3 連鎖不平衡作圖與關(guān)聯(lián)分析

SNPs擁有的這些特征暗示了它應(yīng)該在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。無可爭辯，SNPs最有希望的應(yīng)用領(lǐng)域是通過連鎖不平衡（linkage diseauilibrium，LD）作圖手段來研究單個(gè)基因或基因組區(qū)域與數(shù)量性狀的連鎖關(guān)系[15]。在相關(guān)性分析及作圖過程中，須檢測少數(shù)候選基因上的等位基因，以確定其與哪一表現(xiàn)性狀相關(guān)，或者若要鑒定與某一特定表型相關(guān)的基因區(qū)域，就需要對全基因組進(jìn)行檢測[13]，所需檢測的最少基因座數(shù)取決于不平衡連鎖的程度[16]。

林木QTL定位方面出現(xiàn)了一些新的趨勢。一是對QTL的確認(rèn)，或者QTL在不同群體中轉(zhuǎn)移的研究，即在不同群體中定位QTL以提高其在標(biāo)記輔助選擇中的通用性。目前只有極少數(shù)報(bào)告在兩個(gè)以上的群體中進(jìn)行了QTL的對比研究;二是連鎖不平衡作圖，或稱關(guān)聯(lián)作圖（association mapping）、關(guān)聯(lián)遺傳學(xué)（associantion genetics），即以現(xiàn)有群體或種質(zhì)資源為材料（而不是QTL定位譜系），通過檢測群體內(nèi)連鎖位點(diǎn)間等位基因的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)來解析復(fù)雜性狀，闡明與個(gè)體表型變異有關(guān)的候選基因及其等位基因，即QTN（quantitativetrait nucleotide），這對實(shí)驗(yàn)譜系較難建立的物種特別有用，在林木中剛剛開始應(yīng)用[17]。一般情況下LD越低，QTL定位越精細(xì)，但檢測一個(gè)關(guān)聯(lián)所需的SNP越多；相反，LD越高，QTL定位精度越低，但基因組掃描所需的標(biāo)記數(shù)量則越少。林木為異交物種，遺傳背景雜合度高，LD較低，LD作圖比傳統(tǒng)的QTL作圖具有更高的精度[18];三是利用cDNA芯片分析基因的差異表達(dá)與數(shù)量性狀的相關(guān)，美國北卡羅來納州立大學(xué)Ronald Sederoff的研究小組在巨桉（Encalyptus grandis）中將cDNA芯片上的表達(dá)數(shù)據(jù)作為數(shù)量性狀進(jìn)行研究，并在分離群體中定位，找到了兩個(gè)對材性影響較大的基因[19]。

與先前的QTL作圖相比，LD作圖是利用自然群體中的連鎖不平衡來直接分析SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀的關(guān)聯(lián)，它是利用種內(nèi)史上的重組事件，可利用的重組是無限的，得到的信息可應(yīng)用于整個(gè)群體的遺傳改良，而QTL作圖是基于標(biāo)記和目的基因在家系子代中的分離，分析的是標(biāo)記與基因間的連鎖關(guān)系。僅利用了一代或少幾代的重組，因此重組是有限的且得到的信息只能用于特定的雜交的組合。此外，先前的QTL作圖是基因上某一大的染色體區(qū)段與表型性狀的連鎖，假如在楊樹遺傳圖譜上某一標(biāo)記與QTL的距離約為1cM，對應(yīng)的物理距離約為22萬個(gè)堿基對[20]，有可能包含10幾個(gè)基因，使研究者很難確定哪個(gè)基因與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)。而LD作圖是直接利用基因內(nèi)部一個(gè)或多個(gè)SNPs與表型性狀的連鎖關(guān)系，具有很高的分辨率。在重組率較低的基因組區(qū)域，如著絲粒區(qū)，比常染色質(zhì)區(qū)域有更廣泛的LD?；蛑車娜旧w區(qū)域，重組率較高[14,21]。小麥等作物的基因組被劃分為基因密度較高的區(qū)域和基因相當(dāng)貧乏的重復(fù)DNA區(qū)域，因而整條染色體上的重組率分布是極不均勻的。

4 遺傳圖譜與功能性分子標(biāo)記

林木生長周期長、體積大、造林地立地條件多種多樣，遺傳背景復(fù)雜，高度雜合，有許多重要性狀都是由多基因控制的復(fù)雜性狀，譬如材性、抗性等。要了解這些復(fù)雜性狀的分子機(jī)理，不但要對單個(gè)基因，而且也要對多基因，甚至整個(gè)基因組在同一時(shí)間內(nèi)表達(dá)的所有基因進(jìn)行分析研究。因此，研究者有必要在林木功能基因組學(xué)中開展SNP的連鎖不平衡研究。SNP是多態(tài)性標(biāo)記的無盡的資源，可用于高分辨率遺傳圖譜的構(gòu)建，也可用于那些基于候選基因或整個(gè)基因組的相關(guān)性研究。為了繪制高分辨率的遺傳圖譜，就需要構(gòu)建大小不受限制的作圖群體。亦可利用先前作圖的群體，因?yàn)檫@些群體在多代遺傳以后，重組機(jī)會(huì)較多，有利于改進(jìn)作圖分辨率[22]。而且，對一些育種品系進(jìn)行的多年研究，有助于更準(zhǔn)確地鑒定難判斷的復(fù)雜表型性狀。雖然全基因組多態(tài)性分析所需的標(biāo)記數(shù)量還有待研究，但可知其數(shù)目會(huì)因品種不同和群體不同而有差別。通過建立具有合適水平LD的遠(yuǎn)緣雜交群體和遺傳相關(guān)性分析，可構(gòu)建具有較好分辨率的遺傳圖譜[23]。最近，已報(bào)道了一些校正群體結(jié)構(gòu)對相關(guān)性研究影響的方法[13]。

高密度的基于基因組序列的SNPs分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以使目的基因的作圖更加精細(xì)，使目的基因在基因組的候選區(qū)間大大收窄，甚至有些SNPs位點(diǎn)就在目的基因的編碼區(qū)內(nèi)，為后來的基因克隆、互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和功能驗(yàn)證帶來許多方便[8]。

隨機(jī)DNA分子標(biāo)記基于基因組中隨機(jī)多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)而成，目的基因標(biāo)記基于基因與基因之間的多態(tài)性開發(fā)而成，而功能性分子標(biāo)記基于功能基因基序（motif）中功能性單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)開發(fā)而成。隨機(jī)DNA分子標(biāo)記（random DNA markers，RDMs）與目的基因標(biāo)記（gene targeted markers，GTMs）的開發(fā)可以不依賴于表型，而基于功能基因基序中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)而來的FMs則需要與表型直接相關(guān)[24]。而功能性分子標(biāo)記（functional markers，F(xiàn)Ms）的應(yīng)用可以不用事先構(gòu)建作圖群體和遺傳圖譜而直接應(yīng)用，這在構(gòu)建分離群體親本材料的選擇、系譜選擇及近交選擇等育種工作中非常方便；同時(shí)，在雜交育種及復(fù)合育種中FMs可以將功能等位基因整合到一起，從而防止群體選擇和循環(huán)選擇中有益基因位點(diǎn)的遺傳漂移；此外，F(xiàn)Ms還可以通過在不同變種中選擇等位基因與表型相關(guān)的功能性位點(diǎn)的存在和缺失情況來評價(jià)和區(qū)分種質(zhì)[24]。

5 結(jié)論與展望

植物育種正在向分子技術(shù)與常規(guī)技術(shù)相結(jié)合的方向發(fā)展。可以預(yù)期，SNP的應(yīng)用將促進(jìn)分子標(biāo)記技術(shù)與其他生物技術(shù)的結(jié)合，這對于重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳機(jī)制的分析、目標(biāo)基因的定位和克隆、親緣關(guān)系的正確估計(jì)、親本選配計(jì)劃的科學(xué)制定、選擇效率的提高，以及種質(zhì)資源的研究、開發(fā)和保護(hù)等工作將產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用，也將加速植物育種技術(shù)的革新。功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，為育種技術(shù)變革提供了一個(gè)前所未有的契機(jī)。隨著木本模式植物毛果楊全基因組測序的完成，林木基因組學(xué)進(jìn)入的快速的發(fā)展階段[25]，讓人們了解到了大量的楊樹SNPs信息，對將來如何充分利用楊樹和其他林木的SNPs提供了方便。但是，現(xiàn)階段SNP研究還處于發(fā)展時(shí)期，研究重點(diǎn)還在于SNPs的發(fā)現(xiàn)和SNP分型，離在林木遺傳育種中廣泛應(yīng)用還有一段距離。因此，下一步的研究重點(diǎn)將是：

（1）基因發(fā)掘和基因互作的研究。基于連鎖定位和連鎖不平衡（LD）的方法，在多環(huán)境下發(fā)現(xiàn)影響目標(biāo)性狀的SNP標(biāo)記，并充分考慮到選擇牽連效應(yīng)。在物種的人工進(jìn)化過程中，人們根據(jù)需要會(huì)對某些性狀進(jìn)行選擇，比如矮稈、大穗、大粒、抗病等特性，具有這些特性的個(gè)體或群體在馴化過程中被選擇并保留下來?，F(xiàn)代育種選擇作用史強(qiáng)，從基因組內(nèi)部來看，在一些控制重要農(nóng)藝性狀的基因組區(qū)段，只有極個(gè)別基因（等位變異）被保留下來，其它等位變異則逐步被淘汰，致使一些基因座的遺傳多樣性顯著低于基因組平均水平；同時(shí)對這些基因座的選擇會(huì)導(dǎo)致其兩側(cè)區(qū)域遺傳多樣性顯著低于基因組平均水平，在遺傳學(xué)上將這種現(xiàn)象稱為選擇牽連效應(yīng)（也稱搭載效應(yīng)，hitchhiking effects）。

（2）分子連鎖標(biāo)記的開發(fā)。主要利用等位基因關(guān)聯(lián)(allelic association)和基因互作研究的成果，發(fā)掘新的基因內(nèi)分子標(biāo)記或功能標(biāo)記(functional molecular markers,FM)，標(biāo)記和性狀關(guān)聯(lián)信息(MTA ,marker trait association)，特別是與早期選擇性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，用于基因內(nèi)分子標(biāo)記精確輔助育種。建立高通量低成本的EST-SSR和SNP-SSR基因型平臺(tái)[26]，為育種家提供特殊等位基因的應(yīng)用信息，減少不利基因之間的遺傳累贅。

（3）建立高通量的數(shù)據(jù)庫。雖然近幾年來，SNP標(biāo)記開始應(yīng)用于林木中，并已在多個(gè)樹種中取得初步的進(jìn)展，但主要集中于材性及株型性狀上[27-31]，并研究了部分有關(guān)林木生態(tài)與分子生態(tài)方面[27,29]。隨著目前地球環(huán)境的日益破壞和資源的逐漸減少，選擇高效利用有限資源并達(dá)到生物量的最大產(chǎn)值的性狀指標(biāo)，并與分子標(biāo)記相關(guān)聯(lián)，擴(kuò)大目標(biāo)基因的范圍，并建立較高分辨率的遺傳圖譜。同時(shí)在已有的基因庫數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，整合基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、表觀遺傳學(xué)的最新數(shù)據(jù)，發(fā)展基于互聯(lián)網(wǎng)的基因型和目標(biāo)表型對應(yīng)的計(jì)算機(jī)信息庫。

為了定向培育出與生產(chǎn)緊密相關(guān)的林木新品種，當(dāng)前的作法往往用轉(zhuǎn)基因的方法來導(dǎo)入所需的目標(biāo)基因，來改善林木的目的性狀，從而培育出所需的林木新品種。對于候選基因的篩選以及候選基因的單核苷酸多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)將大大有助于提高轉(zhuǎn)基因技術(shù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如果將表型選擇與其內(nèi)在生理生化和分子機(jī)理的篩選相結(jié)合，也就是常規(guī)育種和現(xiàn)代分子育種相結(jié)合，提到一個(gè)新的高度。

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Applications of Association Analysis in Forest and Tree Improvement

LIU Xi-hua1,ZHANG Li2,XING Jian-hong1,LIANG Yi-chi1
(1.Department of Resources＆Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China；2.Chifeng Academy of Forestry of Inner Mongolia Autonomous Region,Chifeng 024000,China)

The forest's particular characteristics of the long growth cycle and complex genetic background influence the process of genetic improvement.As the third-generation single nucleotide polymorphism(SNP),it has the characteristics of double allelism,high abundance,lower mutation and easy automatic analysis.Through LD mapping,genetic map of high resolution will be constructed.Single nucleotide polymorphism(SNP)plays an important role for functional genomics research and can accelerate innovation of technology of forest tree breeding.

molecular marker；single nucleotide polymorphism；linkage disequilibrium；association analysis

S722

A

1673-4343（2013）04-0088-06

2013-06-17

福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2011N0030）;福建省教育廳科技項(xiàng)目（JA11249）

劉希華，男，福建閩清人，博士，講師；研究方向:林業(yè)生物技術(shù)教學(xué)與研究。