林杰，馮永濤，陳民良，劉希華，邢建宏

（三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004）

無(wú)患子叢生芽誘導(dǎo)及植株再生研究

林杰，馮永濤，陳民良，劉希華，邢建宏

（三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004）

以無(wú)患子葉片為外植體，通過(guò)正交試驗(yàn)，研究無(wú)患子葉片愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽、芽苗生根以及植株再生的最佳培養(yǎng)基組成，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析和方差分析。結(jié)果表明:誘導(dǎo)出葉片愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+0.5 mg·L-1TDZ+0.4 mg·L-12,4-D+6.0 mg·L-1AgNO3，誘導(dǎo)率為86.4℅。誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基是MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1TDZ，分化率為42.5℅。誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基是1/3 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-12,4-D,生根率為45℅。

無(wú)患子；愈傷組織；叢生芽；植株再生

無(wú)患子（sapindus mukorossi Gaerth.）也叫肥皂樹(shù)或洗手果，為無(wú)患子科無(wú)患子屬落葉喬木，在我國(guó)華南等地多有栽培[1]。無(wú)患子為一種多功能植物，其種皮提取物是重要的化工原料，可制成純天然洗滌產(chǎn)品[2]，還可作為優(yōu)良的農(nóng)藥乳化劑[3]。無(wú)患子的種仁含油率高達(dá)40.7％，是生產(chǎn)生物柴油的理想原料[4]。此外，無(wú)患子樹(shù)形優(yōu)美，是優(yōu)良的園林綠化樹(shù)種[5]。無(wú)患子具有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)需求量大，但低效的種苗繁育技術(shù)是制約其產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的瓶頸。

無(wú)患子長(zhǎng)期以來(lái)以種子實(shí)生繁殖為主，造成后代變異較大，篩選出的優(yōu)良個(gè)體的性狀很難保持。同時(shí)，扦插、嫁接等無(wú)性繁殖技術(shù)繁殖系數(shù)較低，很難滿(mǎn)足生產(chǎn)需求，因此，摸索無(wú)患子組培快繁技術(shù)有重要意義。關(guān)于無(wú)患子的組織培養(yǎng)研究已有一些報(bào)道。張鳳龍[6]等利用莖段作為外植體，進(jìn)行了無(wú)患子組織培養(yǎng)的初步研究，獲得了完整的莖芽苗;陳光蓉[7]等利用多因子正交試驗(yàn)研究了無(wú)患子愈傷組織誘導(dǎo)的條件，篩選出了無(wú)患子葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基;周倩[8]等研究了無(wú)患子愈傷組織誘導(dǎo)與芽苗增殖的培養(yǎng)基配方。上述研究?jī)H開(kāi)展了摸索無(wú)患子以芽繁芽、葉片愈傷組織誘導(dǎo)的條件，尚未進(jìn)行由葉片愈傷組織誘導(dǎo)分化叢生芽，進(jìn)而完成植株再生的研究。本研究旨在篩選出以無(wú)患子葉片為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)葉片愈傷組織，利用愈傷組織分化叢生芽，進(jìn)而再生成完整植株的技術(shù)，為其快速無(wú)性繁殖以及以葉片為受體的外源基因轉(zhuǎn)化和種質(zhì)保藏提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 外植體采集與消毒

以筆者所在的課題組在三明地區(qū)篩選出的無(wú)患子優(yōu)樹(shù)為材料，在連續(xù)3 d晴天后摘取幼嫩葉片若干，裝入燒杯中，加入一定量的洗衣粉和純水，攪拌浸泡30 min，之后用純水洗凈，再加入多菌靈溶液浸泡30 min，然后洗凈葉片并用流動(dòng)的水沖洗3 h左右，再用75％的酒精消毒30 s，0.1％的升汞消毒9 min，最后用無(wú)菌水沖洗5次。

1.2 無(wú)患子愈傷組織誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TDZ、2,4-D和AgNO3，培養(yǎng)基pH為5.8，瓊脂9.0 g·L-1，蔗糖30 g·L-1。培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓滅菌20 min后使用。采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行葉片愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。每瓶接種1個(gè)外植體，大小為0.5 cm2。每個(gè)處理30瓶，重復(fù)3次。接種后的外植體置于光強(qiáng)1800 lx，光照12h·d-1，溫度（27±1）℃的環(huán)境中培養(yǎng)，4周后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.3 無(wú)患子叢生芽誘導(dǎo)

采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)NAA、TDZ和KT 3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，每瓶1個(gè)愈傷組織塊，每個(gè)處理30瓶，重復(fù)3次，8周后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.4 無(wú)患子叢生芽生根

L9(34)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化無(wú)患子叢生芽生根的最佳培養(yǎng)基組成，其因素與水平見(jiàn)表3。每瓶接種1個(gè)芽苗，每個(gè)處理30瓶，重復(fù)3次。4周后統(tǒng)計(jì)生根情況。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)的因素與水平

表2 叢生芽誘導(dǎo)的因素與水平

表3 誘導(dǎo)生根的因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)患子愈傷組織誘導(dǎo)

無(wú)患子葉片接種7 d之后，傷口處出現(xiàn)愈傷組織（如圖1-A所示），28d之后，淡綠色顆粒狀愈傷組織把整個(gè)葉片覆蓋?。ㄈ鐖D1-B所示）。誘導(dǎo)情況見(jiàn)表4。由表4可知，所有組合均能不同程度地誘導(dǎo)出愈傷組織，但不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率和愈傷組織生長(zhǎng)速度有差異，其中在1、2、3、6、7、8、9號(hào)培養(yǎng)基上，愈傷組織淡綠色，7、8、9號(hào)培養(yǎng)基上，愈傷組織致密狀；在4、5、6、7、8、9號(hào)培養(yǎng)基上，愈傷組織生長(zhǎng)慢，在1、2、3號(hào)培養(yǎng)基上，愈傷組織生長(zhǎng)快。2號(hào)培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為86.4℅，7號(hào)培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為59.3℅。

試驗(yàn)結(jié)果的極差分析顯示，A因素(TDZ濃度)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率影響最顯著，C因素(AgNO3濃度)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果影響較小，B因素(2,4-D濃度)的影響居中，3個(gè)因素的最佳組合為A1B2C2?？梢?jiàn)，誘導(dǎo)無(wú)患子葉片愈傷組織的最佳培養(yǎng)基組成為：MS+0.5mg·L-1TDZ+0.4mg·L-12,4-D +6 mg·L-1AgNO3。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表5，結(jié)果表明TDZ濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響明顯，而其它兩個(gè)因素的作用不顯著。

2.2無(wú)患子叢生芽誘導(dǎo)

將已經(jīng)誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織切成若干塊接種于含有不同濃度NAA、TDZ和KT的培養(yǎng)基上，30 d后，愈傷組織分化出芽，芽粗壯，莖節(jié)長(zhǎng)，而且分枝形成叢生狀（如圖1-C所示），沒(méi)有分化的愈傷組織逐漸褐變，最后死亡。叢生芽誘導(dǎo)情況見(jiàn)表6。

由表6可知，8號(hào)培養(yǎng)基上叢生芽的誘導(dǎo)率最高，為42.5℅，4號(hào)培養(yǎng)基上叢生芽的誘導(dǎo)率最低，為10℅。極差分析表明，3個(gè)因素的對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)效果的影響大小依次為B→A→C，最優(yōu)組合為A3B2C1。愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽的方差分析列于表7。

從表7中可以看出，TDZ對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)有極顯著影響，NAA對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響達(dá)顯著水平，KT的影響不顯著。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果還顯示，分化率高的組合分化出芽的愈傷組織數(shù)目和平均每塊愈傷組織分化出芽的數(shù)目也多。綜上所述，MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1TDZ是無(wú)患子愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽的理想培養(yǎng)基。

2.3 無(wú)患子叢生芽生根

將分化完全的叢生芽單個(gè)分離轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中，3周后，芽體基部開(kāi)始分化出白色的不定根（如圖1-D所示），30d之后，不定根分化達(dá)到高峰。無(wú)患子芽苗生根情況見(jiàn)表8。

由表8可知，9個(gè)試驗(yàn)處理中生根率、生根條數(shù)、根長(zhǎng)度和最早生根時(shí)間也各不相同，其中7號(hào)處理生根率最高，為45％，6號(hào)處理生根率最低，為27.5％。生根率高的組合其生根條數(shù)較多，相同天數(shù)根長(zhǎng)度較長(zhǎng)，生根時(shí)間較短。極差分析結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)生根率的影響大小各不相同，6-BA濃度對(duì)生根率的影響較大，而MS濃度和2,4-D濃度對(duì)生根率影響不大。

對(duì)生根誘導(dǎo)正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果（表9）顯示，6-BA對(duì)芽苗生根影響最顯著，基本培養(yǎng)基和2,4-D這兩個(gè)因素影響不顯著，上述試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)的生根培養(yǎng)基組成為A3B1C2，綜上所述，誘導(dǎo)叢生芽生根的最佳培養(yǎng)基是1/3 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-12,4-D。生根后的芽苗繼續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月后獲得完整的組培苗（如圖1-E所示）。

圖1 無(wú)患子植株再生過(guò)程

3 討論

外植體的選擇對(duì)于植物的離體快繁尤為重要，無(wú)患子的快繁可采用莖段微扦插、種胚萌發(fā)和葉片誘導(dǎo)體胚或叢生芽等。試驗(yàn)采用無(wú)患子葉片誘導(dǎo)叢生芽實(shí)現(xiàn)植株再生，能夠有效地利用原材料。在無(wú)患子組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，TDZ濃度增加不利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，這與劉淼等[9]得出低濃度的TDZ更適合牛皮杜鵑組培苗葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和分化的結(jié)果一致。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6.0 mg·L-1AgNO3對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)的作用，過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抑制作用。

在無(wú)患子的組織培養(yǎng)中，叢生芽誘導(dǎo)與增殖是一個(gè)十分關(guān)鍵的步驟，在提高芽增殖倍數(shù)的基礎(chǔ)上方能實(shí)現(xiàn)快繁。MS是木本植物組織培養(yǎng)的常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，無(wú)機(jī)鹽濃度相對(duì)偏高，就會(huì)對(duì)植株生長(zhǎng)起到副作用。MS中大量元素含量的減少不利于無(wú)患子葉片的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，這與前人在雷公藤愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽中的結(jié)果相一致[10]。對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)而言，只需要低濃度NAA，但對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)作用卻因物種而異。KT對(duì)無(wú)患子叢生芽的誘導(dǎo)無(wú)顯著影響，這與周倩等[13]在誘導(dǎo)無(wú)患子愈傷組織試驗(yàn)中得到的結(jié)論不一致，這可能是因?yàn)樗x的外植體不同引起的。

生根是無(wú)患子快繁過(guò)程中較難操作的一個(gè)環(huán)節(jié)，其中在根數(shù)上很難突破，從試驗(yàn)中可以看出，大部分生根試驗(yàn)僅出1～2條根。從試驗(yàn)結(jié)果可知，1/3MS與0.5 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1的2.4-D配比最適于叢生芽生根培養(yǎng)，MS中所含的大量元素過(guò)高、6-BA和NAA濃度的增加均不利于根的分化與生長(zhǎng)，這與同科的龍眼莖段培養(yǎng)中的結(jié)果相一致[11]。

本研究摸索出了利用無(wú)患子葉片經(jīng)愈傷組織途徑進(jìn)行植株再生的培養(yǎng)基配方，也為今后利用其它器官進(jìn)行無(wú)患子植株再生提供了參考。但本研究?jī)H從培養(yǎng)基配方對(duì)叢生芽分化、增殖與生根的條件進(jìn)行了優(yōu)化，愈傷組織及繼代增殖效率還不夠高，離工廠化繁育尚有距離，如何優(yōu)化其它培養(yǎng)條件以獲得更高的分化、增殖與生根效率還需要進(jìn)一步研究。

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Study on Induction of Multiple Shoot and Plantlet Regeneration of Sapindus mukorossi Gaerth

LIN Jie,FENG Yong-tao,CHEN Min-liang,LIU Xi-hua,XING Jian-hong
(School of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,Chian)

The best mediums of the callus induction,multiple shoot induction,rooting and plant regeneration were studied by orthogonal design with using the leaves of Sapindus mukorossi Gaerth.as materials in this paper,and the experimental data were analyzed by range analysis and variance analysis.The results showed that the best culture medium for inducing callus from the leaves of Sapindus mukorossi Gaerth.is MS supplemented with 0.5 mg·L-1TDZ+0.4 mg·L-12,4-D+6 mg·L-1AgNO3,with an induction rate of 86.4％.The best culture medium for inducing multiple shoot is MS supplemented with 0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1TDZ,and induction rate of 42.5％.The best culture medium for inducing rooting is 1/3 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-12,4-D,and induction rate is 45％.

Sapindus mukorossi Gaerth；orthogonal design callus；multiple shoot；plantlet regeneration

Q943.1

A

1673-4343（2013）04-0083-05

2013-06-21

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201211311012）；福建省質(zhì)量工程建設(shè)項(xiàng)目（ZL1001/JT(sj)）

林杰，男，江蘇徐州人，大學(xué)生；通訊作者:邢建宏，男，陜西寶雞人，講師。研究方向:林業(yè)與生物技術(shù)研究。