晏嫦妤 李家賢 黃華林 吳華玲 喬小燕 何玉媚

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣州 510640；2.廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣州 510642）

1974年，Grozdicker等［1］在鑒定溫度敏感表型的腺病毒DNA突變體時(shí)，利用限制性內(nèi)切酶酶解后得到的DNA片段的差異，首創(chuàng)了DNA分子標(biāo)記。所謂分子標(biāo)記是指根據(jù)基因組DNA存在豐富的多態(tài)性而發(fā)展起來(lái)的可直接反映生物個(gè)體在DNA水平上的差異的一類遺傳標(biāo)記，它是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記之后最為可靠的遺傳標(biāo)記技術(shù)。DNA分子標(biāo)記以DNA為表現(xiàn)形式，消除了環(huán)境的影響，不存在基因表達(dá)與否和組織器官特異性，因此已被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳育種、基因定位、物種親緣關(guān)系等研究方面。本文綜述了近年來(lái)出現(xiàn)的幾種DNA分子標(biāo)記——ACGM、SRAP、TRAP、SCAR、RSAP 及SCoT的原理、特點(diǎn)及其在茶樹種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用，并對(duì)其在茶樹種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用前景進(jìn)行了分析。

1 幾種分子標(biāo)記的技術(shù)原理和特點(diǎn)

1.1 擴(kuò)增共有序列遺傳標(biāo)記（Amplified consensus genetic markers，ACGM）

ACGM標(biāo)記是Brunel等［2］于1999年依據(jù)模式植物擬南芥（Arabidopsis）與蕓薹屬（Brassica）物種間編碼序列的保守性，首次提出的能夠探知擬南芥和蕓薹屬間共有遺傳信息的一種新型分子標(biāo)記。ACGM是建立在親緣關(guān)系較近的物種間同源基因中編碼序列（外顯子）存在高度保守性，而非編碼區(qū)（內(nèi)含子）存在潛在多態(tài)性基礎(chǔ)之上的一種基于PCR 技術(shù)的分子標(biāo)記。它以一種植物已知功能基因的保守編碼序列為依據(jù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，而在另一種親緣關(guān)系較近、需探知基因功能的植物總DNA中進(jìn)行同源序列擴(kuò)增，并通過(guò)分析擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)進(jìn)一步確定功能相同基因（直向同源基因）的存在與否、拷貝分布、拷貝數(shù)多少以及序列間同源性等。它最大的優(yōu)點(diǎn)是探知新的功能基因而無(wú)需克隆，可以在很大程度上節(jié)省構(gòu)建文庫(kù)和人工誘變突變體的時(shí)間，具有簡(jiǎn)便、快捷的特點(diǎn)［3］。

1.2 相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）

SRAP標(biāo)記是一種基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，是由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros博士［4］于2001年在蕓薹屬植物開發(fā)出來(lái)的。其原理是基于基因外顯子GC含量豐富，運(yùn)用CCGG序列可特異性擴(kuò)增出包含這些組分的序列。而啟動(dòng)子和內(nèi)含子AT含量豐富，可以與含有核心AATT序列的引物特異性結(jié)合。SRAP就是利用這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物對(duì)基因開放閱讀框架進(jìn)行擴(kuò)增。SRAP標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了RAPD和AFLP兩者的優(yōu)點(diǎn)，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、高重復(fù)性、易測(cè)序等特點(diǎn)，并且應(yīng)用少量的引物便可組配得到多對(duì)引物，提高了引物使用效率，降低了引物合成成本。但是由于SRAP標(biāo)記是對(duì)開放讀碼框進(jìn)行擴(kuò)增的，因而對(duì)基因組相對(duì)較少的著絲粒附近以及端粒的擴(kuò)增會(huì)較少，可能使得所構(gòu)建的連鎖圖譜縮短或出現(xiàn)連鎖群斷開的現(xiàn)象。如果結(jié)合可擴(kuò)增這些區(qū)域的SSR標(biāo)記，便可獲得覆蓋整個(gè)基因組的連鎖圖，更好地運(yùn)用于基因分離鑒定及調(diào)控研究等方面［5，6］。

1.3 靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，TRAP）

TRAP是一種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方作物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室Hu與Vick［7］于2003年提出來(lái)的。TRAP技術(shù)是基于已知的cDNA或EST序列信息。目前已獲得許多物種基因組序列的豐富信息，包括人類、擬南芥，以及重要作物水稻和多種微生物的基因組序列草圖繪制成功，有大量的EST序列可供使用，從而使得可以利用生物信息學(xué)工具和EST數(shù)據(jù)庫(kù)信息產(chǎn)生出許多靶基因序列的TRAP多態(tài)性標(biāo)記，而且極易將性狀與標(biāo)記相關(guān)聯(lián)。TRAP由SRAP技術(shù)改進(jìn)而來(lái)，該技術(shù)使用長(zhǎng)度為16-20核苷的固定引物（fixed primer）與隨機(jī)引物（arbitrary prime），固定引物以GenBank中的靶EST序列設(shè)計(jì)而來(lái)；另一個(gè)為隨機(jī)引物，針對(duì)外顯子或內(nèi)含子的特點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)為富含GC或AT核心區(qū)的任意序列。通過(guò)對(duì)目標(biāo)區(qū)域PCR的擴(kuò)增，產(chǎn)生圍繞目標(biāo)候選基因序列的多態(tài)性標(biāo)記［8］。TRAP標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、穩(wěn)定性好、效率高等特點(diǎn)。而且，由于TRAP技術(shù)是基于已知的cDNA或EST序列信息，極易將龐大的EST序列信息和植物重要農(nóng)藝性狀相聯(lián)系，在種質(zhì)資源基因鑒定和作物理想農(nóng)藝性狀基因標(biāo)記上很有幫助。

1.4 序列特定擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記（sequence characterized ampli fied region，SCAR）

SCAR標(biāo) 記 是Paran和Mihcelmore［9］建 立 的一種可靠、穩(wěn)定、可長(zhǎng)期利用的標(biāo)記技術(shù)，是在RAPD標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。先用隨機(jī)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，篩選特異片段，獲取特異的RAPD標(biāo)記，進(jìn)行克隆和測(cè)序，然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，這樣便將與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來(lái)。SCAR標(biāo)記技術(shù)對(duì)比RAPD技術(shù)有以下優(yōu)越性：（1）由于使用較長(zhǎng)的特異性引物和較高的退火溫度，可有效解決RAPD標(biāo)記結(jié)果不穩(wěn)定、重復(fù)性差等問(wèn)題；（2）可將顯性的RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性的SCAR標(biāo)記，解決由于DNA降解對(duì)RAPD帶來(lái)的影響；（3）獲得的條帶單一，克服了RAPD標(biāo)記的不穩(wěn)定和統(tǒng)計(jì)不便等缺點(diǎn)。因此，SCAR標(biāo)記技術(shù)已成為轉(zhuǎn)化RAPD標(biāo)記的一種穩(wěn)定可行的方法［10-12］。

1.5 限制性位點(diǎn)擴(kuò)增多態(tài)性（restriction site amplification polymorphism，RSAP）

RSAP為杜曉華等［13］建立的一種檢測(cè)基因組上廣泛分布的限制性酶切位點(diǎn)多態(tài)性的DNA分子標(biāo)記系統(tǒng)。它的原理是采用2條長(zhǎng)度均為18 bp的引物，引物的5'端為12-14個(gè)堿基的隨機(jī)序列，接著是4-6個(gè)堿基的限制性酶切位點(diǎn)序列，2條引物采用不同的限制性位點(diǎn)和隨機(jī)序列，PCR擴(kuò)增程序借鑒了SRAP技術(shù)，前5個(gè)循環(huán)采用較低的退火溫度以保證擴(kuò)增效率，隨后35個(gè)循環(huán)采用較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟葘?duì)已擴(kuò)片段特異性擴(kuò)增，以保證擴(kuò)增產(chǎn)物的穩(wěn)定。擴(kuò)增產(chǎn)物從6%變性聚丙烯酰胺凝膠中分離，銀染顯色。RSAP標(biāo)記有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）無(wú)需酶切，僅用一個(gè)簡(jiǎn)單的PCR反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA限制性位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，比以往基于限制性位點(diǎn)的標(biāo)記技術(shù)操作更加簡(jiǎn)便；（2）引物可以兩兩隨機(jī)配對(duì)，加上步驟較少，一定程度上降低了成本；（3）擴(kuò)增的限制性位點(diǎn)散布于整個(gè)基因組區(qū)；（4）具有中等產(chǎn)率、穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)和較廣泛的適用性。

1.6 起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，SCoT）

SCoT分子標(biāo)記技術(shù)是一種目標(biāo)分子標(biāo)記技術(shù)，是由Collard和Mackill［14］在水稻研究中提出的，其依據(jù)植物基因中的ATG 翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)單引物并對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用簡(jiǎn)單的瓊脂糖分離檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)是SCoT標(biāo)記的核心。一系列研究表明，基因的起始密碼子的附近序列非常保守，具有一致性。SCoT標(biāo)記的引物就是根據(jù)植物基因中的ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼區(qū)域的保守性來(lái)設(shè)計(jì)的。在SCoT標(biāo)記中的單引物與RAPD、ISSR單引物的作用幾乎相同，同時(shí)充當(dāng)上下游引物，不同的是SCoT單引物可同時(shí)結(jié)合在雙鏈DNA的正負(fù)鏈上的ATG翻譯起始位點(diǎn)區(qū)域，從而擴(kuò)增出兩結(jié)合位點(diǎn)之間的序列。SCoT分子標(biāo)記作為一種新型分子標(biāo)記有幾大特點(diǎn)：（1）建立在PCR基礎(chǔ)上的單引物擴(kuò)增，操作簡(jiǎn)單，易于各種物種SCoT標(biāo)記技術(shù)體系的建立；（2）和ISSR標(biāo)記相比，它是一種目的基因分子標(biāo)記，能有效產(chǎn)生和性狀連鎖的標(biāo)記，方便分子標(biāo)記輔助育種；（3）使用了較長(zhǎng)的引物長(zhǎng)度，理論上比RAPD標(biāo)記重復(fù)性好；（4）引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，可在原有引物序列基礎(chǔ)上做少許改動(dòng)來(lái)設(shè)計(jì)更多新引物，設(shè)計(jì)好的SCoT標(biāo)記引物可以在物種間通用。

2 幾種分子標(biāo)記在茶樹種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用

分子標(biāo)記對(duì)于研究茶樹的遺傳多樣性和鑒定優(yōu)質(zhì)品種資源具有重要作用。多種分子標(biāo)記如RFLP、RAPD和AFLP等已經(jīng)應(yīng)用于茶樹種質(zhì)鑒別，遺傳多樣性分析，遺傳穩(wěn)定性和遺傳作圖等領(lǐng)域。目前，上述新型分子標(biāo)記技術(shù)在植物分類學(xué)［15］、遺傳多樣性［16］、遺傳圖譜構(gòu)建［17］和輔助育種［18］等方面的研究廣為應(yīng)用，但在茶樹種質(zhì)資源方面的研究應(yīng)用較少，主要集中在遺傳多樣性及特異標(biāo)記方面。

沈程文等［19］采用表型鑒定與SRAP分子標(biāo)記，對(duì)25份廣東茶樹種質(zhì)和5份對(duì)照品種的遺傳多樣性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)和分類，表明21對(duì)SRAP引物共擴(kuò)增出127條帶，其中114條為多態(tài)性帶，占88.67%；平均每個(gè)引物組合的譜帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)分別為6.05條和5.43條，當(dāng)遺傳距離為0.39 cm時(shí)，茶樹種質(zhì)可分成A、B、C 3類，其中A類占83.33%；當(dāng)遺傳距離為0.31 cm時(shí)，又可將A群劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)亞群，其中第Ⅰ亞群包括13個(gè)品種，第Ⅱ亞群包括2個(gè)品種，第Ⅲ亞群包括10個(gè)品種。該研究證實(shí)了SRAP分子標(biāo)記在檢測(cè)茶樹種質(zhì)資源多態(tài)性方面具有較高的效率，并且該分子標(biāo)記是針對(duì)開放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增，增加了擴(kuò)增結(jié)果與表型性狀的相關(guān)性。

唐玉海［20］利用TRAP技術(shù)對(duì)16個(gè)茶樹品種進(jìn)行研究，從35對(duì)TRAP引物組合中，選用了18對(duì)多態(tài)性較好的組合，總共產(chǎn)生了72條條帶，其中多態(tài)性條帶56條，占總條帶的77.78%，條帶大小大約在100-800 bp，平均每個(gè)引物擴(kuò)增4條，多態(tài)性最高為100%，最低為33%。說(shuō)明該標(biāo)記能有效地應(yīng)用與茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析。唐玉海等［20］還通過(guò)與抗旱相關(guān)的幾個(gè)基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行聚類分析顯示，葉型較大，明顯不抗旱的云南大葉和優(yōu)10單獨(dú)聚為一類，而其余幾個(gè)葉型較小，抗旱性較好的品種聚為一類，初步揭示了種質(zhì)的抗旱性差異。該項(xiàng)研究說(shuō)明了TRAP分子標(biāo)記能有效地將茶樹的有關(guān)性狀和分子標(biāo)記關(guān)聯(lián)起來(lái)，在茶樹種質(zhì)資源鑒定研究中具有較好的前景。

丁 洲 等［21，22］開 展 了 茶 樹 的RAPD標(biāo) 記 向SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化的研究。結(jié)果表明，用SCAR引物擴(kuò)增的DNA條帶清晰明顯，與RAPD相比，其對(duì)反應(yīng)條件的敏感程度低。因此，特異性和重復(fù)性較好，是一種可以直接指導(dǎo)茶樹生產(chǎn)實(shí)踐的種質(zhì)鑒定方法，解決了RAPD標(biāo)記的不穩(wěn)定性和AFLP標(biāo)記的繁瑣、高成本的問(wèn)題，這也進(jìn)一步證實(shí)了SCAR標(biāo)記的優(yōu)越性。

劉循等［23］以局部發(fā)生的黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus（Quaintance）為對(duì)象，利用SCAR標(biāo)記技術(shù)獲得了長(zhǎng)度為987 bp的黑刺粉虱特異性片段（GenBank登錄號(hào)為FJ613323），根據(jù)此片段的堿基序列設(shè)計(jì)黑刺粉虱特異性引物1對(duì)（AS-F518/ASR938）。該研究以SCAR標(biāo)記技術(shù)成功地將黑刺粉虱與其他種類的粉虱如桔綠粉虱、煙粉虱（B型、Q型、ZHJ-1型和ZHJ-2型）、溫室粉虱、螺旋粉虱等進(jìn)行了有效區(qū)分，體現(xiàn)了其特異性。通過(guò)該項(xiàng)研究說(shuō)明，SCAR分子標(biāo)記技術(shù)有望在茶樹苗木調(diào)運(yùn)的害蟲檢疫和監(jiān)測(cè)/檢測(cè)中得到實(shí)際應(yīng)用。

3 幾種分子標(biāo)記在茶樹遺傳育種中的應(yīng)用前景分析

對(duì)于應(yīng)用分子標(biāo)記輔助育種的關(guān)鍵是要找到一些與性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，而TRAP標(biāo)記是基于已知的cDNA或EST序列信息，極易將EST序列信息和植物重要農(nóng)藝性狀相聯(lián)系。到2012 年6月12日為止，在GenBank的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的茶樹ESTs已有28 794條，因此將TRAP技術(shù)應(yīng)用在茶樹育種上找到一些與茶樹優(yōu)良性狀相關(guān)的標(biāo)記，對(duì)加快茶樹優(yōu)良性狀的鑒定及品種選育具有重要意義。

隨著功能基因組學(xué)研究的深入和生物信息學(xué)的發(fā)展，目的基因分子標(biāo)記和功能性分子標(biāo)記越來(lái)越來(lái)受到研究者的重視，因其本身可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密聯(lián)鎖，這樣通過(guò)對(duì)某個(gè)分子標(biāo)記的篩選即能對(duì)性狀進(jìn)行篩選，從而加速育種進(jìn)程［24］。近幾年，目的基因分子標(biāo)記類型被廣泛開發(fā)并應(yīng)用。SCoT標(biāo)記技術(shù)是一種除SRAP、TRAP等標(biāo)記外一種能跟蹤性狀的新分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)已被成功應(yīng)用于水稻［25］、花生［26］和龍眼［27］中。植物間基因功能的保守性決定了基因序列的保守性，利用功能基因保守序列開發(fā)出來(lái)的SCoT 標(biāo)記可轉(zhuǎn)移性更強(qiáng)。來(lái)自單子葉植物（水稻）的SCoT 標(biāo)記引物，在雙子葉植物花生中的擴(kuò)增效果也很好，說(shuō)明SCoT 標(biāo)記可在不同物種間共用。因此，該技術(shù)有望在茶樹育種中得到應(yīng)用，推動(dòng)茶樹功能型分子標(biāo)記的研究開發(fā)。

4 小結(jié)

各種DNA分子標(biāo)記技術(shù)從誕生到發(fā)展至今都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，在各自特定的領(lǐng)域中均具有不可替代的作用，雖然目前這些分子標(biāo)記在茶樹種質(zhì)資源研究中應(yīng)用較少，但隨著茶樹分子生物學(xué)數(shù)據(jù)及資源的不斷增多加之生物信息學(xué)、基因芯片等新技術(shù)的不斷發(fā)展及其與分子標(biāo)記技術(shù)的相互融合和相互滲透，DNA分子標(biāo)記技術(shù)將在茶樹種質(zhì)資源研究領(lǐng)域有更廣泛的用途和前景。如ACGM標(biāo)記，能夠探知親緣關(guān)系較近的物種間的同源基因的功能，對(duì)于茶樹這種遺傳背景復(fù)雜，且基因序列研究較少的物種，可以通過(guò)一些和茶樹親緣關(guān)系較近且功能基因研究較多的物種進(jìn)行ACGM標(biāo)記，找到一些新的功能基因。

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