譚亞清 劉德虎

（中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081）

1974年，Gospodarwicz等［1］首次從牛腦垂體中分離純化出一種促進卵巢細胞系分裂增殖的富含賴氨酸和精氨酸的堿性多肽，并將其命名為成纖維細胞生長因子。成纖維細胞生長因子是一個大的蛋白質(zhì)家族，到目前為止已發(fā)現(xiàn)了不少于23個成員。酸性成纖維細胞生長因子（aFGF）是由Thomas等［2］于1984年從牛腦中分離純化得到的，它的等電點為5-7，呈酸性，故以之命名，是第二個被分離純化的成纖維細胞生長因子家族成員，因此相對應的命名第一個堿性多肽為堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）。aFGF是哺乳動物組織中存在的一種正常而微量的物質(zhì)，主要分布于腦、腎臟等器官或組織中，對來源于中胚層及神經(jīng)外胚層的多種細胞均具有促分裂作用。因其在促進胚胎發(fā)育、器官形成、血管再生、潰瘍愈合及創(chuàng)面修復等［3］臨床應用多方面作用明顯而成為國內(nèi)外研究的熱點。

1 aFGF的結構

人的aFGF基因位于第4號染色體上，是一個由2個大的內(nèi)含子和3個外顯子組成的單拷貝基因。aFGF主要分布于腎臟和腦組織中，是一種胞質(zhì)蛋白，其本身缺乏N端信號肽結構，主要通過自分泌和旁分泌兩種方式對周圍細胞起作用。人的aFGF多肽由154個氨基酸殘基組成，分子量為16 kD，是一個不含二硫鍵的全β折疊蛋白，其二級結構是由12條反平行的β鏈組成的三葉草結構，在人的aFGF機構中，這種三葉草結構并不是單獨起作用的，至少存在兩個結構上相互獨立的功能單位［4］。這種結構與其在功能上的特異性有著密切聯(lián)系，它的功能區(qū)主要包括肝素結合區(qū)、受體結合區(qū)和核轉(zhuǎn)位區(qū)。

1.1 肝素結合區(qū)

該區(qū)域分布大量的帶正電荷的堿性氨基酸殘基，通過與帶負電荷的肝素相結合激活aFGF受體。肝素是一類糖胺聚糖，aFGF與之結合后接觸面游離蛋白質(zhì)的熔解溫度升高，三級結構的構象發(fā)生改變，由此導致其穩(wěn)定性和活性都增加［5］。此外，與肝素結合后還能防止其被熱、極性pH變性及蛋白酶水解。1993年，Margalit等［6］用計算機圖形技術分析肝素與蛋白結合的三維結構發(fā)現(xiàn)，不同蛋白與肝素結合區(qū)域的堿性氨基酸有著共同的空間分布特點，這種分布形成了可容納肝素的空隙，從而使肝素和蛋白交織在一起，進而影響蛋白的生物學活性。

1.2 受體結合區(qū)

人酸性成纖維細胞生長因子通過激活特定的橫跨膜的酪氨酸激酶受體起作用。酸性成纖維細胞生長因子受體（acidic fibroblast growth factor receptor，aFGFR）由3部分組成：3個免疫球蛋白樣結構域（D1、D2和D3）組成的胞外配體結構域、跨膜螺旋結構域和胞質(zhì)分散的酪氨酸蛋白激酶結構域。aFGFR主要包括4種緊密聯(lián)系的亞型：即FGFR1-4。aFGFR不僅能與aFGF結合，還能與FGFs家族的其他成員相結合，因此不具特異性［7］。對晶體結構研究發(fā)現(xiàn)，aFGF與aFGFR配體的特異性結合主要決定于胞外結構域D2和D3以及它們之間的僅由4個氨基酸殘基組成的連接肽段：aFGF與FGFR2的配體結構域中的D2的作用部位是β1、β1/β2轉(zhuǎn)角、β3/β4 環(huán)、β9、β10/β11環(huán)、β12和C末端；與D3作用的位點部位是β4/β5發(fā)夾、β6、β7/β8環(huán)、β8和N端的第5-9位氨基酸殘基；與連接肽段的作用部位是N末端、β8、β9和β12［8］。

1.3 核轉(zhuǎn)位區(qū)

aFGF能通過非經(jīng)典的跨膜機制進入細胞核促進細胞分裂和DNA的合成，稱為核轉(zhuǎn)位。這一過程依賴于aFGF N末端的27個氨基酸殘基，特別是第21-27位之間的核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）：Asn-Tyr-Lys-Lys-Pro-Lys-Leu，也稱為核轉(zhuǎn)位區(qū)，其對aFGF的促有絲分裂活性十分重要。去除該序列后，aFGF雖然仍能被膜表面受體識別并引發(fā)早期促有絲分裂事件如胞內(nèi)受體介導的酪氨酸磷酸化和c-los的表達，但是喪失了誘導DNA合成和細胞增殖的能力［9］。Lin等［10］認為，aFGF的NLS在促有絲分裂活性中存在兩方面功能：（1）介導aFGF的核轉(zhuǎn)位：aFGF與受體結合后進入胞內(nèi)，通過NLS與胞內(nèi)組織相結合促進aFGF的核轉(zhuǎn)移；胞內(nèi)aFGF單體可以通過自由擴散的方式進入細胞核，而對于aFGF-aFGFR復合物形式的轉(zhuǎn)位，這個作用就是必須的。（2）直接參與aFGF誘導核促分裂作用信號的產(chǎn)生，這可能是由NLS與核內(nèi)或核膜上特定分子的結合引起的。因此，去除NLS的aFGF的改構體也就喪失了核轉(zhuǎn)位能力和促有絲分裂能力。

2 aFGF的生物學功能

haFGF具有廣泛的生物學活性，能夠通過和受體結合實現(xiàn)對中胚層及神經(jīng)外胚層來源的多種細胞的生長、分化及功能產(chǎn)生影響。其生物學活性分為兩大類型：（1）促有絲分裂活性，可促進組織細胞分裂、增殖，包括胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、血管生成及組織損傷修復等；（2）非促有絲分裂活性，包括舒張血管、心肌保護、局部缺血保護和神經(jīng)保護等。

2.1 胚胎發(fā)育

Fu等［11］研究大鼠胚胎發(fā)現(xiàn)，aFGF廣泛分布于大鼠胚胎的中胚層和神經(jīng)外胚層組織中，在胚胎發(fā)育過程中隨著細胞的生長、遷移和分化而不斷變化。aFGF能增加胚胎早期轉(zhuǎn)錄因子的表達，誘導背側(cè)中胚層的形成，因此被視為胚胎早期背側(cè)發(fā)育的營養(yǎng)因子。在對爪蟾的研究發(fā)現(xiàn)，aFGF及FGFR作為中胚層的誘導因子集中分布在半球，低水平刺激酪氨酸蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導途徑，維持中胚層基因的表達，誘導中胚層的形成［12］。

2.2 血管生成

haFGF可以直接參與新生血管的形成過程。章斌等［13］向內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)液中加入一定量的aFGF，結果發(fā)現(xiàn)，其對血管內(nèi)皮細胞的生長有非常明顯的促進作用，而血管內(nèi)皮細胞的增殖和分化是血管新生的重要環(huán)節(jié)。aFGF發(fā)揮促血管生成作用尚需有組織缺血、缺氧的因素存在，在正常組織內(nèi)，aFGF無促進血管生長的作用，在缺血或缺氧的狀態(tài)下，組織對aFGF的表達上調(diào)，刺激毛細血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生膠原酶和纖維蛋白水解酶，促進膠原的水解和血管內(nèi)皮細胞管腔樣結構的形成［14］。

2.3 損傷修復

皮膚的創(chuàng)傷修復是一個復雜的動態(tài)的生物學過程，aFGF在這個過程中發(fā)揮著重要作用：趨化炎細胞浸潤創(chuàng)面，促進血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞分裂增殖，加速肉芽組織形成和創(chuàng)面的再上皮化，抑制膠原纖維的過量形成，避免瘢痕的產(chǎn)生。劉炘等［15］通過大鼠創(chuàng)傷模型觀察重組人酸性成纖維細胞生長因子在創(chuàng)面愈合中的作用發(fā)現(xiàn)，aFGF在創(chuàng)面愈合的前期可以促進肉芽組織生長，加快傷面愈合；后期又可直接或間接的促進成纖維細胞的凋亡，維持細胞增殖與凋亡的平衡，避免瘢痕組織的形成。aFGF能促進血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和肌纖維母細胞等多種細胞的分裂增殖并能誘導血管新生，因此其對內(nèi)臟的缺血性損傷亦有保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，腸缺血-再灌注損傷后注射aFGF，一段時間后測得肝腎功能指標：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血尿素氮和血肌酐均有升高，說明aFGF對腸缺血-再灌注損傷后的肝、腎功能均有保護作用［16］。轉(zhuǎn)基因小鼠心肌特異性過表達人類aFGF，其微動脈和主冠狀動脈分支的數(shù)目明顯增多，從而使冠狀動脈的血流量增多，延緩心肌梗塞面積的擴大，降低心肌缺失損傷，保護心?。?7］。因此，將aFGF同時用于促進皮膚組織損傷的修復與內(nèi)臟缺血性損傷的修復，顯示出aFGF在臨床應用的極大優(yōu)越性。

2.4 神經(jīng)營養(yǎng)

在體外培養(yǎng)條件下，aFGF能對多種神經(jīng)元如海馬、下丘腦、脊髓等中樞性神經(jīng)元及睫狀體、視網(wǎng)膜等外周性神經(jīng)元有神經(jīng)營養(yǎng)作用。aFGF能促進神經(jīng)元的存活和軸突的生長。Li等［18］研究發(fā)現(xiàn)，向大鼠腹膜腔或側(cè)腦室注射葡萄糖能夠有效的改善大鼠的記憶功能。這是因為注射葡萄糖后大鼠腦室的室管膜細胞會產(chǎn)生aFGF，經(jīng)過2 h擴散到下丘腦、海馬等大腦軟組織，aFGF通過作用于海馬從而促進記憶功能的改善。aFGF對視神經(jīng)元同樣具有營養(yǎng)作用，在對新生大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，結合肝素的aFGF具有促進軸突的起始和延伸的作用［19］。此外，aFGF還能夠促進中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)損傷后的修復和再生，研究證實aFGF能夠促進成年大鼠切斷脊神經(jīng)根的功能性復原［20］。

2.5 骨骼生長

aFGF通過影響軟骨細胞和成骨細胞的活動從而促進骨骼生長。aFGF在體外培養(yǎng)中可促進分化中的軟骨細胞發(fā)生遷移和集落形成，促進離體的軟骨細胞前質(zhì)的分化、軟骨細胞的增殖和成熟。向關節(jié)腔注射重組人酸性成纖維細胞生長因子可以較好地延緩兔膝骨關節(jié)炎軟骨退行性變和預防骨關節(jié)炎的發(fā)展［21］。陳紀寧等［22］研究發(fā)現(xiàn)，向試驗側(cè)管內(nèi)注入aFGF，2周后即在骨斷端髓腔、骨內(nèi)膜及皮質(zhì)斷面處有新骨形成，并長入管內(nèi)血腫，8周后血腫已基本被骨組織代替，達到骨愈合，說明aFGF可有效促進大鼠引導性骨再生，增強其修復骨缺損的能力。這一作用是因為骨基質(zhì)中的由成骨細胞分泌的aFGF具有有絲分裂活性，在骨損傷修復過程中，可刺激骨生成細胞增殖和毛細血管生成，促進骨再生。

2.6 其他功能

此外，aFGF還有攝食的調(diào)節(jié)、抗輻射、影響人體免疫系統(tǒng)、激素調(diào)控、細胞抗凋亡、細胞遷移、止疼和催眠等多種功能。

3 haFGF在基因工程方面的研究

haFGF作為人體內(nèi)的微量活性物質(zhì)，雖然在人體內(nèi)分布很廣但含量甚微，僅靠傳統(tǒng)方法從體液或組織中提取，成本太高難以滿足日益擴大的臨床需求。自1982年重組人胰島素作為世界上第一個基因工程產(chǎn)品問世以來，現(xiàn)代生物制藥技術的開發(fā)應用有了突破進展，為aFGF的批量生產(chǎn)帶來了希望，為多種疾病的治療帶來了福音。

1986年，Jaye等［23］首次從人腦中克隆了haFGF基因，并測定其核苷酸編碼序列，證實aFGF缺乏經(jīng)典的信號肽序列，自此aFGF的研究進入DNA重組階段。1992年，Zazo等［24］首次在大腸桿菌中成功表達了完整形式的haFGF蛋白，此前沒有通過基因工程在大腸桿菌中得到過全長154個氨基酸的aFGF。汪浩勇等［25］將編碼haFGF的基因插入到質(zhì)粒pBV220的EcoR I位點，獲得了能夠高效表達具有aFGF生物活性產(chǎn)物的工程菌株，表達產(chǎn)物約占菌體總蛋白的15%，主要以包涵體的形式存在，使國內(nèi)首次解決了大量獲得haFGF純品的問題。

為了進一步提高重組haFGF的表達量、改善表達產(chǎn)物的生物活性及穩(wěn)定性、擴大外源aFGF的來源，國內(nèi)外學者已經(jīng)成功在昆蟲細胞、家蠶、酵母、哺乳動物和植物等多種不同表達系統(tǒng)中實現(xiàn)了表達。

1990年，Cao等［26］通過核型多角體桿狀病毒感染，實現(xiàn)了haFGF在草地貪夜蛾Sf9細胞中的過表達。由于haFGF缺少經(jīng)典的N末端信號肽序列，從細胞中釋放出來的效率非常低。重組蛋白的表達產(chǎn)物約為10-20 pg每個細胞，感染48 h和72 h后培養(yǎng)基中只含有總蛋白產(chǎn)量0.5%和1.3%，這進一步證明了aFGF不能通過正常的跨膜途徑分泌到胞外或是直接通過質(zhì)膜。2001年，Wu等［27］用攜帶人酸性成纖維細胞生長因子cDNA的重組桿狀病毒感染家蠶幼蟲，通過組織分布分析，表達產(chǎn)物主要位于家蠶的脂肪體中，在注射約80 h后，重組aFGF表達量達到最大值，表達水平高達600-700 μg每只幼蟲。桿狀病毒表達系統(tǒng)能夠提供一個強的多角體啟動子和對重組蛋白進行翻譯后修飾，研究證實其是一個有效且用途廣泛的真核表達工具。2007年，F(xiàn)antoni等［28］分別構建了haFGF的畢赤酵母胞內(nèi)型和分泌型表達載體，并使一端帶上His6標簽。轉(zhuǎn)化后得到的4種酵母菌株經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)均有蛋白產(chǎn)物產(chǎn)生，其中以胞內(nèi)型haFGF重組蛋白的表達量最高，菌株經(jīng)發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)后每升培養(yǎng)物可達到108 mg，相當于0.68 mg/g濕細胞，是以往報道的全長haFGF產(chǎn)量的30倍，實現(xiàn)了具有生物活性的haFGF的大量生產(chǎn)。2011年，Zhou等［29］構建了aFGF乳腺特異性表達載體，并在人乳腺癌細胞MCF-7中實現(xiàn)了成功表達，這項研究使將轉(zhuǎn)基因牛作為乳腺生物反應器成為可能。由于動物乳腺作為生物反應器生產(chǎn)的重組蛋白能夠進行正確的翻譯后修飾，且牛奶作為重組蛋白分離純化的原材料具有安全、充足、容易獲得等優(yōu)點，動物乳腺生物反應器成為人們公認的商業(yè)上可行的生產(chǎn)重組蛋白的有效途徑。2011年，F(xiàn)an等［30］利用農(nóng)桿菌介導的真空滲透瞬時表達體系，將haFGF基因?qū)胪愣够蚪M中，目的蛋白獲得了成功表達并檢測到了活性，在12-15 d內(nèi)就能得到重組haFGF產(chǎn)物。用植物表達外源蛋白有許多優(yōu)勢，如能夠正確進行折疊和翻譯后的修飾，操作簡單、產(chǎn)品安全，成本低廉、易于大規(guī)模生產(chǎn)等，并且無動物細胞的病毒和病原菌對人造成傷害的危險［31］。因此用植物生物反應器生產(chǎn)haFGF具有廣泛的應用前景。haFGF已經(jīng)先后在多種不同的重組表達體系中實現(xiàn)成功表達，盡管獲得有生物活性的重組haFGF蛋白的難度很大，人們經(jīng)過對高效表達體系的探索和分離純化方法的改進，成功獲得了與天然haFGF活性接近的重組haFGF，并且使重組蛋白表達量不斷增加。對于aFGF的藥用研究，國外僅在實驗室階段；我國于2001年批準了與aFGF相關的兩項國家專利，并批準了暨南大學醫(yī)藥中心研究的由大腸桿菌生產(chǎn)的重組haFGF作為一種外用創(chuàng)傷藥物（艾夫吉夫）進入臨床試驗階段。aFGF已經(jīng)成為我國具有獨立知識產(chǎn)權的一類基因工程新藥［32］。

4 aFGF應用于臨床需注意的問題

aFGF在皮膚的損傷修復過程中發(fā)揮重要作用，被廣泛應用于燒燙傷、潰瘍、移植等多種皮膚損傷的修復。李校堃等［33］對皮膚用藥的藥代動力學研究證明，重組的haFGF不能透過正常皮膚進入體內(nèi)，皮膚受損后，可通過破損表皮進入血液循環(huán)，但吸收量很少，由于haFGF的半衰期較短，用藥3 h后血液中的含量便基本消失，因此在體內(nèi)無蓄積作用；吸收后rhaFGF對皮膚有較大的親和力可向其他皮膚擴散，且遠處皮膚含量較高。臨床上皮膚損傷形成的微環(huán)境多成酸性，aFGF的等電點是5-7，在酸性條件下呈現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和生物學活性。許華等［34］對皮膚用藥的長期毒性研究證實，rhaFGF在有效劑量的15倍以下進行皮膚用藥是安全的。

aFGF廣泛的生物學活性使其可以用于多種疾病的治療，但其強大的光譜的促有絲分裂活性在臨床使用中會引發(fā)正常組織增生甚至癌變等多種意料之外的嚴重后果，極大的限制了aFGF的廣泛應用［35］。因此，將aFGF用于臨床治療時，使用的時機、劑量、途徑和部位等都應受到嚴格控制。此外，雖然我國對aFGF用于多種疾病的治療研究已經(jīng)取得了很大進展，但要使其廣泛的應用于臨床，還需要經(jīng)過長期的臨床試驗觀察和全面的安全性評價［36］。

5 aFGF的改構體

為了使aFGF得到廣泛的應用，避免其廣譜的絲裂原活性在臨床應用中帶來的副作用，國內(nèi)外學者進行了大量的研究。haFGF基因N端27個氨基酸對絲裂原活性十分重要，將該序列去除得到的非促分裂haFGF（nonmitogenic haFGF，nhaFGF） 改構體，喪失了誘導細胞分裂等促有絲分裂活性，但仍保持著原有aFGF的舒張血管、神經(jīng)調(diào)節(jié)、心肌保護和局部缺血保護等作用［37］。翁立新等［16］利用改構型aFGF和野生型aFGF治療腸缺血再灌注損傷后大鼠，結果表明兩種aFGF對腸缺血再灌注損傷后的肝、腎功能均有保護作用，且無明顯差異。目前，aFGF改構體的部分藥效已經(jīng)得到證實，更多的保護機制正在探求中，改構體去除了絲裂原活性，減少了人們對體內(nèi)用藥安全性的擔憂，對aFGF的廣泛應用具有重要意義。

6 展望

aFGF具有廣泛的生物學效應，在臨床上有重要的作用，既可用于治療燒燙傷、潰瘍、切口等創(chuàng)面愈合，又可治療機體缺血損傷、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨骼修復及眼晶狀體再生等多種疾病，越來越受到人們的重視。nhaFGF改構體的研究大大拓寬了aFGF的應用范圍，使aFGF更加廣泛地應用于臨床。aFGF廣泛的臨床應用價值使其與其他多種藥物相比展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，但由于受到活體試驗和倫理學的限制，人們對aFGF多種活性的作用機制并不是十分清楚，還需要研究者通過大量的動物試驗作進一步完善。今后還應繼續(xù)對aFGF的結構組成、功能活性和信號轉(zhuǎn)導等基礎領域進行深入研究，為aFGF的實際應用提供理論基礎和試驗依據(jù)，以期在臨床應用中使aFGF的作用得到更大的發(fā)揮，使aFGF具有更為廣闊的應用前景。

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