莊蘇，丁立人，周建國(guó)，王恬

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京210095）

在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中，有關(guān)外源酶制劑應(yīng)用一直存在著不少爭(zhēng)議。因?yàn)榱鑫竷?nèi)蛋白質(zhì)水解菌能分解外源酶（如植物細(xì)胞壁水解酶類）而使之失活［1］，同時(shí)瘤胃微生物能分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等多種酶類，并且各種酶活性很高［2］，因此無需額外添加外源酶制劑。但是，隨著酶制劑技術(shù)的發(fā)展，人們除了重視外源酶在單胃動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用研究外也開始關(guān)注外源酶制劑在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用研究。研究表明，某些纖維素酶、半纖維酶與蛋白酶一起培養(yǎng)時(shí)能保持穩(wěn)定酶活，并在瘤胃內(nèi)穩(wěn)定生存［3］；外源酶制劑能夠增加瘤胃微生物在飼料顆粒上的附著并增加飼料降解率［4］；Morgavi等［5］發(fā)現(xiàn)由長(zhǎng)梗木霉（Trichodermalongibrachiatum）產(chǎn)生的酶能與瘤胃內(nèi)酶一起協(xié)同地從玉米（Zeamays）青貯中釋放更多的還原糖；同樣外源纖維水解酶能改善動(dòng)物生產(chǎn)性能［6，7］。即便如此，外源酶制劑在反芻動(dòng)物生產(chǎn)應(yīng)用研究還不夠深入，對(duì)其作用機(jī)理認(rèn)識(shí)還不夠全面。就目前研究現(xiàn)狀而言，更多研究集中在外源酶制劑如何處理粗飼料（如作為青貯飼料添加劑）上［8，9］，有關(guān)外源酶制劑的處理時(shí)間、添加劑量以及外源酶對(duì)內(nèi)源酶活性的影響研究相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)在這方面研究?jī)H處于起步階段。本試驗(yàn)以羊草為底物，利用體外法研究不同劑量纖維酶與木聚糖酶、不同處理時(shí)間與瘤胃液共培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵液中纖維素酶與葡聚糖酶活性與發(fā)酵特性的影響，旨在為豐富外源纖維水解酶在反芻動(dòng)物中的應(yīng)用提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與時(shí)間

酶制劑為國(guó)產(chǎn)纖維素酶（40 000U/g）與木聚糖酶（42 000U/g）產(chǎn)品。使用時(shí)，用去離子水配制成各含10與50mg/mL纖維素酶與木聚糖酶混合酶液。發(fā)酵底物為羊草（Aneurolepidiumchinense）草粉。試驗(yàn)于2009年10月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究室進(jìn)行。

1.2 瘤胃液采集

選取5只體況良好、體重35～40kg裝有永久瘤胃瘺管的本地閹割山羊用于瘤胃液供體。試驗(yàn)羊圈養(yǎng)，適量補(bǔ)飼精料（玉米∶豆粕＝7∶3），自由采食青干草與飲水。瘤胃液采集當(dāng)日，在飼喂后2h，經(jīng)瘤胃瘺管分別從5頭山羊的瘤胃腹囊下部抽取含內(nèi)容物的瘤胃液，放入經(jīng)39℃預(yù)熱并充滿CO2的保溫瓶中，立即返回實(shí)驗(yàn)室，用4層紗布分離內(nèi)容物，濾液作為混合瘤胃微生物接種物，整個(gè)過程在厭氧條件下進(jìn)行。

1.3 緩沖液制備

緩沖液參照Russel和Martin［10］的配方制備。將緩沖液裝入廣口瓶中，加入1%刃天青數(shù)滴，通CO2直至緩沖液呈無色為止，此時(shí)表示已達(dá)到厭氧條件。

1.4 接種液配制

將緩沖液預(yù)熱至39℃，在厭氧條件下按緩沖液與瘤胃液為4∶1（V/V）制備接種液。制備完成后立即使用。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)6組。分組如下：24h酶處理組，分別稱取2.0g羊草裝入150mL發(fā)酵瓶?jī)?nèi)，然后用注射器在羊草上均勻地噴灑含酶劑量為0，10.0與50.0mg/mL酶液1mL，3組分別標(biāo)記為24－0，24－10與24－50，并置于20℃培養(yǎng)箱中處理24h后，向瓶?jī)?nèi)注入CO2排除空氣，接著向瓶?jī)?nèi)加入預(yù)熱至39℃接種液50mL，整個(gè)過程伴隨CO2通入以維持厭氧條件，分裝完畢后迅速蓋上異丁基橡膠塞密封，并以鋁蓋固定封口，最后置于39℃下培養(yǎng)。另3組為0h酶處理組：在裝入2.0g羊草瓶?jī)?nèi)均勻地噴灑酶劑量為0，10.0與50.0mg/mL酶液1mL，3組分別標(biāo)記為0－0，0－10與0－50，通入CO2后直接加入接種液，余下操作同24h處理組。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.6 樣本采集與處理

在4，6，8，12，24，36，48h培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)分別從每組中取出3個(gè)發(fā)酵瓶用氣壓轉(zhuǎn)換儀測(cè)定產(chǎn)氣量并計(jì)算累積產(chǎn)氣量，同時(shí)對(duì)其他發(fā)酵瓶進(jìn)行放氣處理，所有操作過程均在39℃條件下進(jìn)行。在0（接種后立即采樣），8，24，48h培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)分別從每組中取出3個(gè)發(fā)酵瓶，打開瓶蓋立即測(cè)定發(fā)酵液pH值，然后將發(fā)酵瓶?jī)?nèi)全部?jī)?nèi)容物倒入尼龍袋（200目，孔徑0.074mm）分離發(fā)酵液與內(nèi)容物。發(fā)酵液分裝于3個(gè)10mL離心管中，置于－20℃冰柜中用于后期酶活性與揮發(fā)性脂肪酸（VFA，volatile fatty acid）測(cè)定。每次取樣后該時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵瓶棄用。

1.7 樣品測(cè)定與方法

分別以濃度為20mg/mL的燕麥木聚糖（X－0627購(gòu)自Sigma）、羧甲基纖維素鈉（國(guó)產(chǎn)）與Avicel PH101（購(gòu)自Fluka）溶液用于木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶與外切葡聚糖酶酶活測(cè)定底物。在pH 6.0和50℃條件下反應(yīng)30min測(cè)定酶活力［11］。酶活（U）定義為此測(cè)定條件下1min內(nèi)釋放1nmol的木糖或葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位。

島津GC－14B氣相色譜儀測(cè)定VFA含量［12］并略作改進(jìn)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理后，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中GLM模塊中Multivariate進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)預(yù)處理時(shí)間、酶劑量、預(yù)處理時(shí)間與酶劑量間的互作效應(yīng)。對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)采用One－way ANOVA中Duncan’s法進(jìn)行多重比較，顯著水平置于0.05。結(jié)果用平均數(shù)與平均標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維水解酶對(duì)體外發(fā)酵液木聚糖酶活性的影響

在0h，酶量、處理時(shí)間顯著影響木聚糖酶酶活（P＜0.05）；兩者互作效應(yīng)為0.092（表1）。在8h，酶量顯著影響木聚糖酶活性（P＜0.05）；高劑量酶組酶活均顯著高于其他處理組（P＜0.05），而處理時(shí)間對(duì)酶活的影響不顯著（P＝0.127），酶量與處理時(shí)間無互作效應(yīng)。在24與48h，酶量與處理時(shí)間效應(yīng)、酶量與處理時(shí)間互作效應(yīng)均不顯著（P＞0.05）；但在24h，24h處理的高劑量組酶活高于無酶組與0h處理的高劑量組（P＜0.05）。

表1 纖維水解酶對(duì)體外發(fā)酵液中木聚糖酶活性的影響Table 1 Effect of the fibrolytic enzymes on xylanase activity in vitro nmol/（min·mL）

2.2 纖維水解酶對(duì)體外發(fā)酵液內(nèi)切、外切葡聚糖酶活性的影響

在0與8h，酶量與處理時(shí)間均顯著影響內(nèi)切葡聚糖酶活性（P＜0.05）（表2）；其中0h時(shí)間點(diǎn)，兩者存在互作效應(yīng)（P＜0.05）；高劑量顯著增加內(nèi)切葡聚糖酶活性（P＜0.05）。與0h比較，8h內(nèi)切葡聚糖酶活性大幅下降，下降幅度在65.52%～73.12%。當(dāng)發(fā)酵至24與48h，酶量、預(yù)處理時(shí)間效應(yīng)以及兩者間的互作效應(yīng)均不顯著（P＞0.05）。

在0h，酶量、處理時(shí)間顯著影響發(fā)酵液中外切葡聚糖酶活性 （P＜0.05）；劑量與處理時(shí)間具有一定的互作效應(yīng)（P＝0.06）；24h酶處理組發(fā)酵液中外切葡聚糖酶活性顯著高于其他各組（P＜0.05）。在發(fā)酵8h，僅處理時(shí)間對(duì)酶活性產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05）。發(fā)酵24與48h，酶量、處理時(shí)間及兩者間互作效應(yīng)均不顯著 （P＞0.05）。

表2 纖維水解酶對(duì)體外發(fā)酵液中葡聚糖酶活性的影響Table 2 Effect of the fibrolytic enzymes on glucanase activity in vitro nmol/（min·mL）

2.3 纖維水解酶對(duì)體外發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

在0h點(diǎn)，發(fā)酵液中乙酸含量在22.19～22.61mmol/L（表3），酶量、處理時(shí)間效應(yīng)、酶量與處理時(shí)間互作效應(yīng)對(duì)乙酸含量均無顯著影響（P＞0.05）。當(dāng)發(fā)酵至8h，外源酶具有增加乙酸含量作用的趨勢(shì)（P＝0.091）；而處理時(shí)間效應(yīng)、酶劑量與處理時(shí)間互作效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。在24與48h，添加酶劑量顯著增加發(fā)酵液中乙酸含量（P＜0.05），50mg酶處理組均顯著高于無酶組（P＜0.05）；處理時(shí)間對(duì)乙酸產(chǎn)量沒有影響并且酶劑量與處理時(shí)間之間沒有互作效應(yīng)（P＞0.05）。

丙酸含量顯示，在0h，酶劑量、處理時(shí)間效應(yīng)、酶劑量與處理時(shí)間互作效應(yīng)均不顯著影響丙酸含量（P＞0.05）。在8與24h，外源酶有增加發(fā)酵液中丙酸含量的趨勢(shì)并有劑量效應(yīng) （P＝0.055與P＝0.052）。發(fā)酵48 h，各組丙酸含量無顯著性差異（P＞0.05）。

在8h，添加酶制劑顯著提高丁酸含量 （P＜0.05）。在其他各時(shí)間點(diǎn)，酶劑量、處理時(shí)間效應(yīng)及兩者的互作效應(yīng)均不顯著（P＞0.05）。

除0h外，添加外源酶顯著地增加總VFA含量（P＜0.05），而處理時(shí)間效應(yīng)、酶劑量與處理時(shí)間的互作效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。

外源酶添加量與預(yù)處理時(shí)間并不影響發(fā)酵液中戊酸與異戊酸含量 （P＞0.05）。

表3 纖維素水解酶對(duì)體外發(fā)酵液中VFA含量的影響Table 3 Effect of the fibrolytic enzymes on VFA content in vitro mmol/L

2.4 纖維水解酶對(duì)體外發(fā)酵體系中pH值與產(chǎn)氣量的影響

在發(fā)酵8與24h，酶劑量效應(yīng)、酶劑量與處理時(shí)間互作效應(yīng)顯著影響發(fā)酵液pH值 （P＜0.05）（表4）。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，處理時(shí)間顯著影響pH值（P＜0.05）。產(chǎn)氣量分析，酶量、處理時(shí)間顯著影響48h累積產(chǎn)氣量（P＜0.05），但兩者沒有互作效應(yīng)（P＝0.954）。

表4 纖維素水解酶對(duì)體外發(fā)酵體系中pH值與總產(chǎn)氣量的影響Table 4 Effect of the fibrolytic enzymes on pH value and cumulative gas production in vitro

3 討論

3.1 外源酶制劑對(duì)體外瘤胃發(fā)酵酶活的影響

在反芻動(dòng)物日糧中添加外源酶制劑能夠增加飼料消化率和動(dòng)物生產(chǎn)性能［13－15］。外源酶制劑作用機(jī)理歸類為3個(gè)方面：首先，采食前外源酶預(yù)處理飼料以增加底物消化率［16］；其次，在瘤胃內(nèi)外源酶直接或間接與瘤胃微生物協(xié)同作用分解飼料底物［5］；第三，外源酶增強(qiáng)后段消化道的消化能力［17］。在反芻動(dòng)物應(yīng)用中，外源酶無論通過何種作用途徑產(chǎn)生效果，其關(guān)鍵點(diǎn)是外源酶能否抵抗瘤胃微生物降解。本研究發(fā)現(xiàn)，羊草經(jīng)過0或24h混合酶處理后與瘤胃液共培養(yǎng)，在起始點(diǎn)，添加外源酶能顯著增加培養(yǎng)液中木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性，且效果與酶添加量、處理時(shí)間相關(guān)（P＜0.05）。培養(yǎng)至8h，添加高劑量外源酶分別提高發(fā)酵液木聚糖酶與內(nèi)切葡聚糖酶活性65%與20%，結(jié)果與在生長(zhǎng)母牛瘤胃中直接投放多糖酶分別提高瘤胃內(nèi)木聚糖酶與內(nèi)切葡聚酶活性67%與20%［18］以及綿羊瘤胃液中內(nèi)切葡聚酶活性51%與木聚糖酶活性34%［19］結(jié)果基本一致。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)（24或48h），外源酶作用效應(yīng)消失。試驗(yàn)結(jié)果與Colombatto等［20］發(fā)現(xiàn)的外源酶能增加早期（前6h）體外發(fā)酵液中木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶及β－D－葡聚糖苷酶活性，但不能提高48h酶活性結(jié)果一致。綜合分析認(rèn)為，在培養(yǎng)起始階段，由于添加外源酶，培養(yǎng)體系中葡聚糖酶與木聚糖酶瞬間得到提高；當(dāng)培養(yǎng)到8h，添加外源酶也能增加培養(yǎng)體系纖維水解酶活性，這說明本次使用的外源酶制劑在一定時(shí)間內(nèi)能抵抗微生物降解并保持活性。前人試驗(yàn)證明木聚糖酶能夠抵抗蛋白酶的水解［21］，纖維水解酶不被瘤胃微生物降解失活［22－24］。因此，本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究基本一致。除纖維水解酶外，外源蛋白酶也能增加瘤胃內(nèi)木聚糖酶與內(nèi)切葡聚糖酶活性，增加纖維素在瘤胃中降解［25］。由此可以得出，外源酶在反芻動(dòng)物中應(yīng)用是可行的。

3.2 外源酶制劑對(duì)體外瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

為了獲得有效的飼料消化率，在動(dòng)物采食前將飼料與酶進(jìn)行預(yù)處理是必要的，但并非是必須的。Lewis等［16］試驗(yàn)表明，外源纖維水解酶無論是采食前24h還是0h處理粗飼料，整個(gè)消化道干物質(zhì)、中性洗滌纖維與酸性洗滌纖維消化率均顯著提高。在采食后16h，酶處理組瘤胃液中總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著高于無酶組，但與酶處理時(shí)間關(guān)系不大。有人認(rèn)為酶與飼料可形成一個(gè)穩(wěn)定的酶－飼料復(fù)合體［7］，改變植物纖維結(jié)構(gòu)［26］，繼而釋放更多的還原糖，有利于增加奶牛瘤胃中纖維二糖利用菌、木聚糖水解菌以及淀粉水解菌的數(shù)量［27］，最終影響瘤胃發(fā)酵與產(chǎn)物的生成。Krzysztof和Magdalena［28］報(bào)道纖維水解酶能提高奶牛瘤胃液TVFA含量以及不同組分脂肪含量，但對(duì)乙酸丙酸比及各類型脂肪酸占總脂肪酸比例沒有影響。Giraldo等［29］體外試驗(yàn)表明外源酶能顯著增加瘤胃中VFA產(chǎn)量（P＜0.05），其中乙酸占到增加量50%。而Giraldo等［19］研究發(fā)現(xiàn)直接投飼外源纖維素酶并不影響綿羊瘤胃液中TVFA量，但是顯著提高丙酸的摩爾比例，降低乙酸與丙酸比（P＜0.05）。綜合體內(nèi)試驗(yàn)［18，30，31］與體外試驗(yàn)［32］研究結(jié)果，纖維水解酶對(duì)不同類型飼料可產(chǎn)生不同的VFA摩爾比例，日糧特性以及外源酶的類型均能影響瘤胃發(fā)酵類型。本研究發(fā)現(xiàn)，外源酶添加劑量直接影響培養(yǎng)液中VFA生成量，顯著影響24與48h發(fā)酵液中乙酸生成量及8，24與48hTVFA生成量（P＜0.05），而VFA產(chǎn)量與酶處理時(shí)間關(guān)系不大。結(jié)果提示外源酶對(duì)乙酸的生成量影響程度遠(yuǎn)高于對(duì)丙酸與丁酸生成程度，而對(duì)戊酸與異戊酸的含量沒有影響。分析原因這可能是添加外源酶后，增加前期發(fā)酵液中木聚糖酶與內(nèi)切葡聚糖酶活性，有利于底物中半纖維素與纖維素的水解，從而增加了乙酸菌生長(zhǎng)所需的底物，斷而增加乙酸產(chǎn)量。但是能否增加培養(yǎng)體系中乙酸菌數(shù)量還需進(jìn)一步研究。從培養(yǎng)液pH值變化情況可知，pH值下降與培養(yǎng)液中VFA含量增加同步。

除酶活性與VFA產(chǎn)量等指標(biāo)外，產(chǎn)氣量則是體外發(fā)酵程度的另一個(gè)重要指標(biāo)。Wallace等［33］評(píng)價(jià)了2種商業(yè)纖維水解酶與瘤胃液共培養(yǎng)對(duì)玉米青貯與牧草青貯發(fā)酵特性的影響，結(jié)果顯示，在前8h發(fā)酵期，外源酶線性地增加產(chǎn)氣量。Tang等［34］試驗(yàn)表明纖維水解酶與酵母發(fā)酵物能夠改善谷物秸稈的發(fā)酵過程，酵母培養(yǎng)物顯著地增加累積產(chǎn)氣量，纖維水解酶則傾向增加累積產(chǎn)氣量。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，添加外源酶能夠顯著地提高最終累積產(chǎn)氣量，且產(chǎn)氣量與外源酶添加劑量呈顯著相關(guān)。結(jié)合酶活性與VFA產(chǎn)量結(jié)果分析，可以推測(cè)由于外源纖維水解酶添加增加培養(yǎng)液中纖維水解酶活性，從而加速底物的水解速度，繼而增加培養(yǎng)液中還原糖生成量，這為瘤胃微生物提供更好營(yíng)養(yǎng)源，最終結(jié)果是增加了培養(yǎng)體系中總VFA產(chǎn)量。

4 結(jié)論

用外源纖維水解酶處理羊草后與瘤胃液共培養(yǎng)能夠顯著地提高發(fā)酵早期（前8h）反應(yīng)體系中木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶與外切葡聚糖酶活性，提高反應(yīng)體系中VFA產(chǎn)量以及改善瘤胃發(fā)酵特性。

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