馬霞，王麗麗，李衛(wèi)軍，宋江平，何媛，羅明＊

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，新疆 烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境學院，新疆 烏魯木齊830052）

苜蓿（Medicago）以其適應性強、產(chǎn)草量高、富含蛋白質(zhì)等特點被稱作“牧草之王”，同時還具有改土肥田、保持水土、改善生態(tài)環(huán)境的作用，是西部地區(qū)草地建設和荒漠化改造中首選的豆科牧草［1］。近年來隨著農(nóng)業(yè)種植結構的調(diào)整和西部地區(qū)“退耕還草”工程的實施，苜蓿種植面積的擴大，對苜蓿種子的需求量不斷增加，采取一定的技術措施提升苜蓿種子的生產(chǎn)水平，建立高產(chǎn)、高效、優(yōu)質(zhì)的種子產(chǎn)業(yè)體系，是促進苜蓿產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的關鍵。研究和生產(chǎn)實踐證明，苜蓿接種根瘤菌可以促進苜蓿早結瘤、多結瘤和增加固氮量，是提高苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)的重要措施［2，3］。研究表明，根瘤菌—苜蓿形成的高效共生體系能固定90～386kg/hm2的純氮，可提供其生長期所需46%～92%的氮素［4］。美國約80%的苜蓿在播種前進行根瘤菌接種，在加拿大、澳大利亞等國家該技術也已被普遍接受［5，6］。

根瘤菌與苜蓿的共生固氮作用是一個非常復雜的相互作用過程。根瘤菌的固氮效率受根瘤菌基因組、宿主基因組和土壤環(huán)境因子等多方面因素的影響，其中土壤化合態(tài)氮素含量是嚴重影響結瘤和固氮功能的重要因子［7］。因此，在苜蓿種子生產(chǎn)中如何充分發(fā)揮根瘤菌的共生固氮作用，避免氮肥施用的盲目性，是一個尚待解決的科學問題。本研究利用15N自然豐度法測定不同施氮水平下接種根瘤菌對苜蓿的固氮效能、苜蓿生長和種子產(chǎn)量的影響，探明能充分發(fā)揮根瘤菌固氮作用，經(jīng)濟有效地施用氮肥量，為建立苜蓿種子高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效的生產(chǎn)體系提供科學基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地設在呼圖壁種牛場新疆農(nóng)業(yè)大學草地生態(tài)試驗站。試驗站海拔446m，年平均溫度7.5℃，年最高溫度39.4℃，年最低溫度－32.1℃，生長季平均溫度17.9℃，無霜期178d，冬季有積雪，平均降水量150mm，年蒸發(fā)量2 300mm，潛水埋深平均1.8m。試驗區(qū)為耕種多年的農(nóng)田，有灌溉條件，土壤為輕度鹽澤化的灰鈣土。

1.2 試驗材料

1.2.1 供試根瘤菌菌種 根瘤菌為苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobiummeliloti）ACCC17544，分離自新疆紫花苜蓿（M.sativa），由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2.2 供試苜蓿品種 新牧一號紫花苜蓿，由新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境科學學院提供。

1.2.3 培養(yǎng)基及營養(yǎng)液 根瘤菌培養(yǎng)采用甘露醇酵母汁培養(yǎng)基（YMA）（g/L）［8］：甘露醇 10.0，NaC1 0.1，Mg2SO4·7H2O 0.2，酵母粉1.0，K2HPO40.5，蒸餾水1 000mL，pH 值7.0～7.2。

苜蓿沙培采用無氮營養(yǎng)液（g/L）［9］：KH2PO40.14，MgSO40.49，H3BO30.001，MnCl20.001，ZnSO40.001，CuSO40.000 1，鉬酸鈉0.001，Na2Fe EDTA 0.02。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計 2009－2010年設置采用田間小區(qū)試驗。試驗采用4×3二因素設計。因素一為：不同施氮水平。尿素施用量分別為：0（N0）kg/hm2、50（N50）kg/hm2、100（N100）kg/hm2、150（N150）kg/hm2；因素二為：根瘤菌接種處理，設秋播拌種、春季追施接種2個處理，同時設不接種為對照。共計12個處理，每個處理3次重復，共36個小區(qū)。小區(qū)面積3m×3m，隨機區(qū)組排列。三料過磷酸鈣（有效P2O5含量43%，300kg/hm2）作為基肥一次性施入。尿素分別在第2年苜蓿返青的苗期（1/3總施肥量）、現(xiàn)蕾期（1/3總施肥量）、花期（1/3總施肥量）以追肥施入，施肥后澆水。常規(guī)田間管理，適時澆水、除草、防病蟲害，及時清除菟絲子。

1.3.2 根瘤菌接種液制備 接種液制備：活化根瘤菌菌種，接種至YMA液體培養(yǎng)基中，120r/min，30℃，搖瓶培養(yǎng)至菌液OD600值為0.5～0.8，備用。

1.3.3 接種與播種 采用2種方式接種：1）拌種：將苜蓿種子在菌液中浸泡15min后立即播種。2）溝施：于第2年苜蓿返青時在幼苗根部開溝追施根瘤菌液。均以無菌液體培養(yǎng)基拌種為對照。根瘤菌液濃度為2.14×108個/mL，苜蓿播種量為3kg/hm2，條播。

1.3.4 參比植物 在苜蓿田間小區(qū)試驗行間種植黑麥草（Loliumperenne）作為不固氮對照植物［10］。

1.3.5 苜蓿沙培試驗 通過沙培試驗測定在外源氮素100% 源于大氣的條件下苜蓿植株15N同位素豐度。將河沙反復清洗、干燥后定量裝入營養(yǎng)缽內(nèi)。種子經(jīng)表面消毒后催芽。選取發(fā)芽均勻一致的種子，用根瘤菌液浸種15min后播種于裝有河沙的營養(yǎng)缽中。苜蓿生長期間定期定量澆無氮營養(yǎng)液。同時以無菌YMA培養(yǎng)液浸種的處理作對照。

1.3.6 測定項目 苜蓿生長性狀和種子產(chǎn)量：分別在苜蓿返青期、幼苗期、分枝期、成熟期從各處理小區(qū)用修枝剪隨機采集20株地上部分植株，105℃殺青2h，65℃烘干4h至恒重，稱量干重。當3/4的莢果變?yōu)楹诤稚珪r人工收獲，每個樣方人工收獲1m2植株，統(tǒng)計各處理植株有效分枝數(shù)、莢果數(shù)，干燥后脫莢、種子清選，稱重獲得小區(qū)凈種子產(chǎn)量。

根瘤菌結瘤數(shù)、根瘤重量：分別在苜蓿返青期、幼苗期、分枝期從各處理小區(qū)隨機取10株，每株按長×寬×深（30cm×30cm×30cm）挖取苜蓿根系。將苜蓿根系放在網(wǎng)篩上沖洗，將泥沙洗凈后取出根瘤，用吸水紙吸干表面水分，計數(shù)有效根瘤數(shù)、稱重根瘤鮮重。

苜蓿植株的生物固氮量：采用15N自然豐度法測定［11，12］。植株收獲后，65℃烘干、粉碎。莖葉15N%用精密同位素質(zhì)譜儀測定（測量精度為0.01‰），全氮用凱氏定氮法測定［13］。計算不同處理的根瘤菌固氮百分率、固氮量［14］。根瘤菌固氮百分率（Ndfa%）即苜蓿生物固氮量占其全部同化氮素量的百分比，通過下式計算：

式中，δ15Ns為非固氮參照植物（與苜蓿生長在同一試驗小區(qū)的黑麥草）的15N 豐度，δ15Nf為試驗小區(qū)苜蓿的15N豐度，δ15Na為生長于無氮培養(yǎng)基質(zhì)上的苜蓿15N豐度。根瘤菌固氮量用下式計算：

式中，Ndfa為單位面積苜蓿的生物固氮量（kg/hm2），Ndfa%為苜蓿生物固氮所占比例，Mlb為單位面積苜蓿生物量（kg/hm2），Cnc為苜蓿植株全氮含量（kg/kg）。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Excel 2003和DPS 7.05軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對苜蓿結瘤數(shù)和根瘤重的影響

在苜蓿上接種根瘤菌能增加苜蓿單株根瘤數(shù)量和根瘤重量（圖1和2）。與不接種處理相比，單株根瘤數(shù)平均增加（31.1±0.165）%，單株根瘤重平均增加（45.4±0.248）%。其中接種根瘤菌在低施氮（N50）水平下表現(xiàn)尤為突出，與不接種處理差異極顯著（P＜0.01），顯著高于不施氮、N100和N150的施氮處理。超過N50的施氮量，隨著施氮量的增加，單株根瘤數(shù)和根瘤重則呈現(xiàn)出下降的趨勢，與不施氮處理無顯著差異。試驗結果表明，適量施用低濃度的氮肥可以提高苜蓿的根瘤數(shù)及重量，明顯改善苜蓿的結瘤狀況，但過多的氮肥則會抑制根瘤菌結瘤。同時，試驗結果表明，接種方式對根瘤菌的侵染結瘤產(chǎn)生一定影響。秋播拌種有利于增加根瘤重量，春播追施更利于增加根瘤數(shù)量。

圖1 不同處理下苜蓿的根瘤數(shù)Fig.1 The nodule number of alfalfa under different treatments

圖2 不同處理下苜蓿根瘤鮮重Fig.2 The nodule fresh weight of alfalfa under different treatments

2.2 不同處理對苜蓿生物固氮率、固氮量的影響

不同處理苜蓿固氮率、固氮量的結果表明（圖3和4），在不施氮肥（N0）和施用少量氮肥（N50）條件下，人工接種根瘤菌較不接種能顯著提高苜蓿的生物固氮百分率和固氮量，固氮率平均提高了（91.1±0.032）%和（17.3±0.004）%，固氮量平均提高了（110.9±0.218）% 和（71.6±0.120）%。且在低施氮水平下（N50）接種根瘤菌苜蓿固氮率、固氮量都達到最高；而施用更多的氮肥，則引起苜蓿固氮率、固氮量降低。當施氮量達N150時，固氮量降低幅度最大，春季追施和秋播拌種較N50處理分別降低了52.6%和60.5%。在不接種條件下，施氮量N100苜蓿固氮率、固氮量最高，表明接種高效固氮菌較土著菌株可以提高生物固氮能力，替代部分氮肥，減少化肥的施用量。

比較2種接種方式，以秋播拌種根瘤菌結合N50低施氮量處理的苜蓿固氮率、固氮量最高，分別達到了（77.8±0.508）% 和（452.51±2.568）kg/hm2，比返青追施根瘤菌結合施用低氮和不接種的對照分別增加了15.1% 和83.6%。說明對苜蓿接種根瘤菌，采用秋播拌種方式并結合施用一定量的外源氮肥，可以增強其生物固氮的性能，顯著提高固氮量。

2.3 不同處理對苜蓿生長性狀及種子產(chǎn)量的影響

總體而言，通過秋播拌種和春季返青追施方式接種根瘤菌都能有效促進苜蓿生長（表1），在不同施氮水平下其有效分枝數(shù)、單株莢果數(shù)、地上部生物量較不接種對照分別增加了2.3%～48.7%［平均（30.1±8.126）%］、6.7%～47.0% ［平均（25.1±5.254）%］和1.2%～51.7% ［平均（17.0±5.597）%］。其中接種根瘤菌苜蓿的分枝數(shù)、莢果數(shù)在不施氮（N0）和低施氮量（N50）下及地上干物質(zhì)重在N100施氮量下與不接種處理差異達極顯著（P＜0.01）。在不同施氮量下，接種和未接種處理苜蓿植株的地上部生物量都表現(xiàn)出隨著施氮量的增加而增長，在N100水平達到最大值（接種處理不施氮和其他施氮處理差異顯著，未接種各處理間差異未達顯著水平），而超過N100施氮量，根瘤菌促進苜蓿植株生長的效應明顯降低，地上部生物量隨施氮量增加而下降，有效分枝數(shù)的變化也呈現(xiàn)出相似的變化趨勢。而單株莢果數(shù)的變化則呈現(xiàn)出接種苜蓿在N50施氮量下達到最大值，未接種苜蓿在N100時達到最大值，之后均隨施氮量增加而下降的變化特點。

圖3 不同處理下苜蓿固氮百分率Fig.3 The proportion of N fixed by alfalfa under different treatments

圖4 不同處理下苜蓿生物固氮量Fig.4 The amount of N fixed by alfalfa under different treatments

表1 不同處理下苜蓿的生長性狀Table 1 The growth characteristics of alfalfa under different treatments

接種根瘤菌能顯著提高苜蓿種子產(chǎn)量（圖5）。在施氮肥量N50～N150時苜蓿種子均有不同幅度的增加，較其他處理產(chǎn)量增幅平均達（59.7±0.118）%。其中秋播拌種根瘤菌以施氮量N50時的增產(chǎn)最為顯著，產(chǎn)量達到了557kg/hm2，與不施氮肥處理差異極顯著（P＜0.01），而施氮量為N100和N150的處理種子產(chǎn)量無顯著差異。春季追施根瘤菌，以施氮量N100種子增產(chǎn)幅度最為顯著，產(chǎn)量為452kg/hm2。說明根瘤菌的接種時期、接種方法對苜蓿的接種效果不同，以秋播拌種效果較佳。

試驗結果表明，接種根瘤菌結合施用適量氮肥有利于根瘤菌與苜蓿共生關系的建立和固氮效能的發(fā)揮，改善植株的氮素營養(yǎng)，進而促進苜蓿的營養(yǎng)生長，提高其分枝數(shù)，促進干物質(zhì)積累和向莢果中的分配。但施氮量過高則抑制了根瘤固氮功能的發(fā)揮，影響苜蓿生長，造成生物量減少和向莢果中的分配率降低，使增產(chǎn)幅度降低。

2.4 苜蓿生物固氮百分率、固氮量與種子產(chǎn)量的相關性

在不同施氮量下接種根瘤菌，其中秋播拌種接種處理的生物固氮率、固氮量與苜蓿種子產(chǎn)量均呈正相關關系（圖6和7），相關性分別達顯著（P＜0.05）和極顯著水平（P＜0.01）；而春季追施接種處理生物固氮率、固氮量則與種子產(chǎn)量未表現(xiàn)出顯著的線性相關性。

圖5 不同處理下苜蓿的種子產(chǎn)量Fig.5 The seed yield of alfalfa under different treatments

圖6 接種根瘤菌苜蓿生物固氮百分率與種子產(chǎn)量的相關性Fig.6 The relationship between proportion of N fixed and seed yeild of alfalfa inoculated with rhizobia

圖7 接種根瘤菌苜蓿生物固氮量與種子產(chǎn)量的相關性Fig.7 The relationship between amount of N fixed and seed yeild of alfalfa inoculated with rhizobia

3 討論

3.1 施用氮肥對苜蓿根瘤菌固氮能力的影響

根瘤菌與豆科植物結瘤形成共生體是自然界中最為高效的固氮體系，土壤環(huán)境中的生物和非生物因素均能不同程度地影響接種根瘤菌的結瘤和共生固氮效率。研究發(fā)現(xiàn)，由于能源方面的原因，植物根瘤優(yōu)先吸收環(huán)境中的化合態(tài)氮，土壤中化合態(tài)氮素含量是影響根瘤菌固氮效應的重要環(huán)境因子，氮肥施用不合理會阻礙根瘤的形成和降低根瘤的固氮活性［15］。一方面在幼苗期，根瘤菌尚未與植物建立起共生固氮關系，植物生長所需氮素主要從土壤中獲取。施用少量氮肥可以氮換碳，以氮促碳，加強植株的光合作用，促進根系生長，為根瘤菌感染和結瘤創(chuàng)造較好條件，起到“起爆氮”的效應［16，17］。另一方面，土壤中有效態(tài)氮供應增加，能影響根瘤菌對根毛的侵染，降低結瘤數(shù)量，抑制類菌體的固氮酶活性，從而對固氮效率表現(xiàn)出明顯的抑制作用，導致固氮量減少，即產(chǎn)生了“氮阻遏”效應［18］。研究表明隨著施氮水平的增加，宿主植物干物質(zhì)重和葉面積增加，但可減少根系的發(fā)展，根瘤的數(shù)量和生長顯著受到抑制［19，20］。淺召興一郎研究發(fā)現(xiàn)在200mg/L化合態(tài)氮濃度下，籽實百粒重和產(chǎn)量雖然仍有少量增加，但產(chǎn)量及其組成受氮肥的影響已不顯著［7］。姚允寅等［21］研究表明，合理施入低水平的化合態(tài)氮肥能提高苜蓿固氮能力，延長固氮高峰的持續(xù)時間，特別是對初建或低供氮能力的草場，施入化合態(tài)氮肥尤為重要。Gan等［22］研究發(fā)現(xiàn)以25kg/hm2氮肥作種肥，大豆（Glycinemax）的固氮比例最高，84%生物量氮來自生物固氮，而花期施用50kg/hm2追肥則使結瘤狀況和固氮數(shù)量下降，可見氮肥對根瘤固氮能力的影響較為復雜，氮肥施用量、氮肥類型、施用時期和方式等都會影響到根瘤菌的固氮效能［23］。

本試驗結果表明，不同施氮水平下接種根瘤菌對苜蓿固氮效能、苜蓿生長和種子產(chǎn)量的影響有明顯差異。在N50的施氮量下，接種根瘤菌能顯著增加苜蓿單株根瘤數(shù)量和根瘤重量，苜蓿固氮率、固氮量都達到最高，有利于菌株的結瘤和固氮，進而改善植株的氮素營養(yǎng)，促進苜蓿生長，提高了上部干物質(zhì)積累和有效分配，增加有效分枝數(shù)、莢果數(shù)等產(chǎn)量構成因子，最終達到顯著的增產(chǎn)效果。而超過N100施氮量，會抑制根瘤菌結瘤，引起苜蓿固氮率、固氮量降低，根瘤菌促進苜蓿植株生長的效應明顯降低，造成生物量減少和向莢果中的分配率降低，種子增產(chǎn)幅度下降。但本試驗條件下的N50施氮量是否為最佳施氮量？肥料肥效的發(fā)揮受環(huán)境條件的影響很大，該施氮量是否還受到試驗地土壤肥力條件的影響？以及施氮肥的最佳時期，根瘤菌侵染結瘤適宜的環(huán)境氮素水平是否因菌株和苜蓿品種不同而異等問題都還有待進一步研究。針對不同土壤類別和不同氣候條件，找出適合當?shù)貤l件的最佳施肥配比、施肥量、施肥時期和施肥方式等，對因地制宜指導苜蓿生產(chǎn)有重要的理論和實踐意義。

3.2 接種方式對苜蓿根瘤菌固氮的影響

在土壤中接種高效根瘤菌株，建立起有效的寄主—根瘤菌共生體系是充分發(fā)揮根瘤菌固氮潛能的前提條件。接種菌株與宿主形成根瘤是兩者相互作用的一系列復雜過程，由根瘤菌與宿主植物的遺傳因素及生態(tài)因素兩方面決定。其中接種根瘤菌的方式影響根瘤菌在土壤中的定殖、侵染及結瘤的效率，一直是根瘤菌應用過程中的一個關鍵環(huán)節(jié)。前人對根瘤菌的接種方式討論較多，但尚無定論。Maria和Silvina［24］認為種下接種根瘤菌結瘤率最高。唐穎等［25］的研究顯示，采用根瘤菌液體菌劑拌種與顆粒菌肥作種肥施用導致大豆結瘤部位不同，液體菌劑拌種根瘤多集中于根上層，施用顆粒菌肥根瘤多集中于根下層；施用顆粒菌肥在大豆生長后期根瘤數(shù)量及干重均表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，大豆產(chǎn)量高于液體菌劑拌種處理。張紅俠等［26］在黃淮海地區(qū)和黃土高原地區(qū)試驗了噴施、拌種和種下接種根瘤菌對大豆生長及產(chǎn)量的影響。結果表明，黃土高原噴施接種遼寧慢生根瘤菌（B.liaoningense）4345在大豆植株干重、植株全氮量、結瘤率和產(chǎn)量等方面均顯著高于另2個處理和對照，而費氏中華根瘤菌（S.fredii）4338拌種和噴施較好。而在黃淮海地區(qū)拌種更適用于對慢生性大豆根瘤菌（B.japonicum）4302和費氏中華根瘤菌4822菌株的接種。本研究在制種苜蓿小區(qū)試驗中采用根瘤菌菌液對秋播苜蓿拌種和苜蓿春季返青開溝追施2種方法接種，試驗結果表明，2種接種方式都有利于增加根瘤重量，增強生物固氮性能，提高固氮量，顯著提高苜蓿種子產(chǎn)量。但比較而言，秋播拌種結合N50低施氮量處理的效果更加顯著。究其原因可能是秋播拌種形成的根瘤在當年秋季即開始固氮，有效促進了苜蓿前期的營養(yǎng)生長和干物質(zhì)的積累，幼苗生長健壯，同時也為來年返青新生根生長及根瘤的形成、膨大提供了物質(zhì)基礎，因而固氮效率增強，有利于提高產(chǎn)量。而在春季苜蓿返青時開溝追施根瘤菌可能由于土著根瘤菌優(yōu)先占據(jù)的生態(tài)位影響到接種菌的占瘤率，進而影響其固氮效能的發(fā)揮，但此推測還有待標記基因技術研究證實。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)拌種法接種簡便易行，易于推廣，是多年來廣泛采用的方法，但此法也有其缺點，僅適用于新播種苜蓿，不適用于老種植區(qū)［27］。本試驗探討采用春季開溝追施根瘤菌，具有較好的接種效果，對拌種效果不理想或老種植區(qū)補施根瘤菌提供了又一途徑，值得進一步研究。

3.3 15 N天然豐度法估測苜蓿根瘤菌的固氮性能

目前對于固氮植物固氮能力和固氮量估算的方法主要有差值法、乙炔還原法、15N同位素稀釋法和15N天然豐度法等［28］。15N天然豐度法即確定用大氣中15N豐度作為15N的標準自然豐度，應用固氮植物和非固氮植物利用有效氮源的不同而形成的植物15N豐度的差異來測定生物固氮量。該法不需向待測作物生長的土壤中施入昂貴的15N肥料，也不破壞作物生長的正常生態(tài)環(huán)境，通過測定待測植株樣品15N含量即可估算固氮能力［29，30］，特別是在原位條件下研究多年生草本植物和木本植物的固氮量具有其獨特的優(yōu)點。15N天然豐度法對非固氮參比植物的選擇尤為關鍵，否則會對生物固氮量的估算產(chǎn)生大的偏差。杜麗娟等［10］以扁穗雀麥（Bromuscatharticus）、燕麥（Avenasativa）、黑麥草和法拉斯草等非共生固氮禾本科植物作為參比植物，通過測定紫云英（Astragalus sinicus）、圓苜蓿和紫花苜蓿等越冬草本豆科植物固氮百分率的結果來評定所選參比植物的合理性。試驗測算出紫云英、圓苜蓿和紫花苜蓿的固氮百分率分別為（78.0±1.8）%、（183.5±5.3）%和（65.3±1.4）%，結果顯示用所選的4種參比植物測得的圓苜蓿固氮百分率極不合理，而作為紫云英、紫花苜蓿的參比植物所測固氮百分率合理，表明它們吸收土壤氮的比例相似，是適合的參比植物。姚允寅等［14］以牛尾草（Rabdosiaternifolia）和鴨茅（Dactylisglomerata）作參比植物估算7個不同品種苜蓿在不同生長時期的固氮率，發(fā)現(xiàn)用鴨茅做參比植物所得數(shù)據(jù)不合理，而牛尾草做參比植物所得數(shù)據(jù)較好，與15N稀釋法的估測值無明顯差異。本研究在應用15N天然豐度法估測評價不同處理下苜蓿根瘤菌固氮能力的試驗中是以與紫花苜蓿生長在同一試驗小區(qū)的多年生黑麥草作為參比植物，二者生長在具有同樣δ15N豐度的土壤中。經(jīng)測定計算苜蓿地上部分固氮百分率為35.5%～84.6%，此試驗數(shù)據(jù)是合理的，且與前人的測定結果相似［31］，進一步證明了黑麥草吸收土壤氮源δ15N與紫花苜蓿相近，選用黑麥草作為參比植物估測苜蓿根瘤菌的固氮性能是科學可行的。

豆科植物地下部分固N量也不容忽視。有試驗［32］測定華中紅壤丘陵地區(qū)蠶豆（Viciafaba）、紫云英、蘇箭3號、紫花苜蓿等幾種冬季綠肥作物地下部固定的N量占總固N量的比例為11.4%～45.3%。紫花苜蓿與禾草混播，地上部分全年固N量為40～118kg/hm2，如果包括根的固N量，則為52～153kg/hm2。因苜蓿根系發(fā)達，入土很深，取其完整的根系較為困難，本試驗只測定了地上部分的生物固N百分率和固N量，如果包括根部固氮，苜蓿的固N能力可能略高。

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