張志國

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500）

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是由2 個～8 個單糖通過β-糖苷鍵連接形成直鏈寡糖，不能被人體上消化道消化吸收，可以直接進入大腸。經(jīng)過國內(nèi)外科學家的大量研究，低聚半乳糖具有低能量、促進腸道雙歧桿菌的增殖、改善礦物質(zhì)元素的吸收和防止骨質(zhì)減少、改善脂質(zhì)代謝、預防、治療便秘、低致齲齒性、生成營養(yǎng)物質(zhì)，改善營養(yǎng)狀況、提高免疫力、增強抗腫瘤和抗衰老等營養(yǎng)功能[1-2]。

低聚半乳糖在日本已經(jīng)廣泛的被用作甜味劑、糖的替代品、食品原料、功能性食品原料，在各類食品中添加。我國衛(wèi)生部已經(jīng)批準GOS 為新資源食品，并且允許添加在嬰幼兒食品、乳制品、飲料、焙烤食品、糖果中（中華人民共和國衛(wèi)生部公告2008 年第20 號，中華人民共和國衛(wèi)生部公告2007 年第12 號）[3]。

因為低聚半乳糖是一系列半乳糖基低聚糖的混合物，聚合度從2 到8 不等，有15 種以上的組分[4]，用外標法檢測存在一定的困難，所以低聚半乳糖檢測技術(shù)是低聚糖檢測研究的重點。下面從國內(nèi)外低聚半乳糖檢測技術(shù)的研究情況、存在的問題和研究方向分別進行介紹。

1 低聚半乳糖檢測方法研究現(xiàn)狀

低聚半乳糖屬于低聚糖，而低聚糖的分離檢測技術(shù)一直是科研工作者研究的重點。Richard C et al[5]在1986 年采用紙色譜檢測了嬰兒配方乳中的乳果糖和大豆低聚糖，Takamitsu chaka et al[6]采用薄層色譜法分離了藻朊酸纖維低聚糖，Splechtna B et al[7]采用薄層色譜法分析了轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物中的低聚半乳糖。

對于低聚糖的分離檢測技術(shù)，高效液相色譜法研究相對多一些[8]，高效液相色譜法主要利用低聚糖的易溶特性，在糖柱、氨基柱、凝膠柱上分離效果較好的特點，一般采用示差折光檢測器檢測。隨著技術(shù)的進步，Antonopoulos A et al[9]用蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detection，ELSD）檢測低聚糖的研究，蒸發(fā)光散射檢測器比示差折光檢測器檢出限高1～2個數(shù)量級，具有比較好的前景。Hirotaka Kakita et al[10]把單糖和低聚糖進行熒光素衍生后，利用HPLC 法檢測取得了較好的效果。

隨著技術(shù)的發(fā)展，也有用質(zhì)譜進行低聚糖分離和結(jié)構(gòu)分析的研究。林勤保等[11]用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定了大棗低聚糖的單糖組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大棗低聚糖的單糖組成為阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，同時測定了大棗中單糖的組成成分為果糖和葡萄糖，取得了較好的效果。Broberg A[12]用高效液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜進行了低聚糖的分析。Ying Liu et al[13]采用液相色譜和液相色譜串聯(lián)電噴霧電離質(zhì)譜進行了低聚糖分離和鑒定。

另外，馮詠梅等[14]還采用001×7 陽離子交換樹脂柱層析分離提純低聚半乳糖（GOS）混合物，然后采用薄層色譜分析純化結(jié)果。Kamoda S et al[15]采用激光誘導熒光檢測器分析經(jīng)過毛細管電泳分離的N-連接低聚糖，也取得了良好的效果。還有Dreisewerd K et al[16]采用薄層色譜板分離生牛乳中的低聚糖，然后用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜完成分析，也取得了較好的結(jié)果。

下面根據(jù)研究較多的分析方法具體介紹一下檢測低聚半乳糖的方法，有薄層色譜法（Thin Layer Chromatograpy）、氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法。

1.1 薄層色譜法

李玉梅等[17]對低聚半乳糖含量為30%的β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖基發(fā)酵產(chǎn)物進行了分析。利用薄層色譜法和HPLC 法兩種方法。薄層色譜法采用Silica gel 60 制薄層板，展開劑為：正丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2（體積比），薄層顯色劑為：20 %硫酸溶液+0.5 % 3，5-二羥基甲苯，糖顯色條件為：120 ℃烘烤3 min～5 min，然后用ImageJv1.28 軟件進行定量分析。

陸文偉等[18]采用薄層色譜法，并把展開劑調(diào)整為：正丁醇∶正丙醇∶乙醇∶水=2∶3∶3∶2（體積比），分析了轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物中的低聚半乳糖含量（含量超過20%）。

許牡丹等[19]采用上行薄層色譜法以硅膠G 做薄層，正丁醇∶水=85∶15 作展開劑，用苯胺-二苯胺-磷酸溶液作為顯色劑檢測轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物中各個糖組分含量（低聚半乳糖含量大于20%）。

李正義等[20]采用了李玉梅等[17]的相同薄層色譜方法分析了低乳糖牛奶中的低聚半乳糖含量，由于乳糖水解率很高，超過70%，GOS 含量超過20%，所以乳糖的干擾很少。而采用AminexHPX-42C（300mm×7.8mm）糖分析柱，超純水作流動相，柱溫70 ℃的HPLC 條件檢測。轉(zhuǎn)移二糖和乳糖的色譜峰重疊，造成低聚半乳糖含量的檢測結(jié)果偏低，乳糖含量的檢測結(jié)果偏高。

吳昊等[21]對高效薄層色譜法分析低聚半乳糖及其衍生物進行了系統(tǒng)的研究。試驗對薄層厚度、固定相鹽效應、硅膠粘合劑濃度、點樣的技巧以及展開劑的選擇、顯色劑優(yōu)化等進行了優(yōu)化試驗，確定了適合的方法。但是方法適合高低聚半乳糖含量和低的乳糖和半乳糖含量的樣品。

1.2 氣相色譜法

隨著氣相色譜法和衍生技術(shù)的發(fā)展，也有人采用氣相色譜分離檢測碳水化合物，由于糖的高分子量和沸點高的特點，先把多糖水解成單糖，然后采用衍生試劑把單糖衍生成容易氣化的物質(zhì)，采用氣相色譜分離定量，所以氣相色譜主要進行單糖組成及含量的分析，操作相對復雜。

劉建福[22-23]把經(jīng)過分離純化的低聚半乳糖樣品水解、衍生后用氣相色譜分析。試驗采用OV1701 石英毛細管柱（30 m，I.D.0.32 mm），根據(jù)測定的葡萄糖和半乳糖峰面積之比確定分離產(chǎn)物的大致結(jié)構(gòu)，但是沒有給出定量方法。

1.3 液相色譜法

采用高效液相色譜檢測單糖和低聚糖，是目前較為普遍的方法。前面介紹的研究人員還采用液相色譜法和薄層色譜項結(jié)合分析了轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物中的低聚乳糖。比如，李玉梅等[17]還用HPLC 分析了轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物中的低聚半乳糖。將糖漿用0.22 μm 濾膜過濾，以三蒸水作為流動相，柱溫80 ℃，色譜柱為Aminex HPX-42A（300 mm×7.8 mm）糖分析柱。陸文偉等[18]也采用HPLC法測定了轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物中的低聚半乳糖含量，流動相用5 mmol/L 硫酸，柱溫為50 ℃，色譜柱用Aminex HPX 87H。

Barroso Begona et al[24]采用在線高效液相色譜/飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了糖蛋白來源的低聚糖的結(jié)構(gòu)和類型，分析了N 連接和O 連接的低聚糖，取得了較好的效果。

羅倩等[25]研究了利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）對低聚半乳糖柱前衍生化的方法，并采用硅膠柱層析結(jié)合薄層層析，分離檢測原料糖漿中低聚半乳糖，采用紫外光檢測器在波長245 nm 條件下，可以檢測半乳糖、葡萄糖、乳糖、三糖、四糖、五糖。從而進行間接定量。

吳紅京等[26]采用反相高效液相色譜儀，以水作為流動相，分離分析了淀粉經(jīng)過酶水解得到的含2～6 個葡萄糖聚合物的混合物，也取得了比較好的結(jié)果。

李靜芳等[27]研究了高效液相色譜法測定乳制品及糖漿中低聚半乳糖含量的方法。以水和乙腈為流動相，用氨基柱將葡萄糖、半乳糖和乳糖與其他物質(zhì)分離，用示差折光檢測器檢測定量。通過檢測計算低聚半乳糖酶解成的半乳糖含量，來計算樣品中低聚半乳糖含量。葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖的相對標準偏差分別為2.72%、4.16%、1.16%、4.26%。此法的線性相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 5，回收率達到95%～110%。該方?jīng)]有解決水解后樣品溶液中半乳糖和葡萄糖分離的問題，也沒有確定半乳糖換算成低聚半乳糖的換算系數(shù)，推廣意義不大。

1.4 離子色譜法

離子色譜法檢測單糖和低聚糖是比較新的檢測技術(shù)，具有靈敏度高、分離效率好等優(yōu)點。離子色譜法檢測低聚半乳糖首先是美國AOAC 官方公布的標準方法，其他的關(guān)于離子色譜法檢測低聚半乳糖的研究主要是對AOAC 標準方法的改進研究。

1.4.1 美國AOAC 45.4.12-2001.02 標準[28]

AOAC 45.4.12-2001.02《Determination of trans-Galactooligosaccharides（TGOS）in Selected Food Products》標準，依據(jù)的理論基礎(chǔ)是利用特定、專一的β-半乳糖苷酶水解樣品中的乳糖和低聚半乳糖，產(chǎn)物是葡萄糖和半乳糖，再利用樣品中檢測出的乳糖含量計算出乳糖水解來源的半乳糖含量。最后用樣品溶液中總半乳糖含量減去游離的和乳糖水解來源的半乳糖含量，然后用半乳糖增量乘以一個系數(shù)計算得到樣品中低聚半乳糖（GOS）的含量。該標準的操作和計算步驟如下：

①用IC 測出游離的半乳糖和乳糖的量；

②計算乳糖來源的半乳糖的量；

③水解樣品中的乳糖和TGOS；

④用IC 測出水解液中總半乳糖的量；

⑤計算GALGOS=GALT-GALfree-GALLAC；

⑥計算TGOS=k×GALGOS。

注：這里k=（180+162 n）/（180 n），n 是低聚半乳糖分子中半乳糖基的平均數(shù)。

該標準方法用于低聚半乳糖的檢測存在2 個技術(shù)問題：

1）AOAC 45.4.12-2001.02 標準中的計算系數(shù)是由低聚半乳糖的聚合度計算得到的?？墒窃谠囯H檢測中，由于不同生產(chǎn)工藝造成的低聚半乳糖各組分的復雜性，低聚半乳糖的聚合度不能準確測量得到。因為沒有統(tǒng)一的換算系數(shù)，所以該方法只能是給出了檢測思路和方法，推廣的意義不大。

2）因為定量依據(jù)是樣品中半乳糖的增量，所以待測樣品中乳糖或含有半乳糖的碳水化合物的量是影響檢測結(jié)果準確性的最重要因素（該標準已經(jīng)做了說明）。食品尤其是乳粉中的乳糖含量（≥40 g/100 g）遠高于添加的GOS 含量（≤1 g/100 g），這樣由乳糖水解來源的半乳糖含量高于20 g/100 g。而由GOS 水解得到的半乳糖含量不超過總半乳糖含量的5%，從樣品處理、儀器分析的結(jié)果分析這5%增量可以計為非常好的平行結(jié)果，不能用來計算GOS 的含量，因此該方法不適用于乳糖含量高的樣品。

1.4.2 其他的離子色譜檢測方法

采用離子色譜法檢測低聚半乳糖含量的研究基本上都是以AOAC 45.4.12-2001.02 標準為基礎(chǔ)進行的。主要在色譜柱型號、流動相梯度和濃度、β-半乳糖苷酶的添加量等方面進行了研究，也有科研人員利用離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行了一些研究。

Bruggnk C et al[29]用離子交換色譜和單四極質(zhì)譜串聯(lián)做了一些研究，并認為該方法可以分離分析了chicory coffee、蜂蜜、啤酒樣品中的單糖、二糖、三糖和低聚糖。

李建文等[30]在AOAC-2001.02 方法基礎(chǔ)上，優(yōu)化淋洗液梯度，以高效離子色譜-脈沖安培檢測法測定了原料糖漿中的低聚半乳糖含量。

徐莉等[31]參考AOAC-2001.02 方法，用水、250 nmol/L NaOH 溶液和1 mol/L 乙酸鈉溶液梯度淋洗，選用CarboPac PA10（2 mm×250 mm）色譜柱和安培檢測器，研究了離子色譜法測定糖漿中低聚半乳糖含量的方法，測定了糖漿中各組分（乳糖、半乳糖、葡萄糖和低聚半乳糖）的含量。

2 現(xiàn)有方法存在的問題

2.1 樣品通用性

雖然現(xiàn)在有很多技術(shù)進行低聚半乳糖的檢測，但是主要針對低聚半乳糖原料糖漿、轉(zhuǎn)化糖產(chǎn)物等低聚半乳糖含量較高的樣品。包括AOAC 標準在內(nèi)，涉及到的食品樣品也主要是乳糖含量較低和半乳糖含量較低的食品樣品中低聚半乳糖含量的檢測。

2.2 外標法的適用性

工業(yè)化生產(chǎn)使用乳糖酶的來源不同，各生產(chǎn)企業(yè)采用的生產(chǎn)工藝也存在一定的差別，造成了低聚半乳糖組分種類和比例的復雜性，采用外標法檢測存在標準品制備難度大、色譜分離技術(shù)要求高等技術(shù)難點，所以采用外標法進行檢測方法研究的可能性不大。

2.3 經(jīng)驗換算系數(shù)

采用β-半乳糖苷酶把樣品中乳糖和低聚半乳糖水解，通過半乳糖增量計算樣品中低聚半乳糖含量，需要利用樣品中低聚半乳糖中的半乳糖單元的平均數(shù)（半乳糖單元的平均聚合度）來計算得到一個換算系數(shù)。因為低聚半乳糖組分的復雜性，所以到目前為止還沒有一個統(tǒng)一的換算系數(shù)，導致即使測得來源于低聚半乳糖的半乳糖增量，也無法計算出樣品中低聚半乳糖的含量。

2.4 樣品中乳糖含量

考慮到采用AOAC-2001.02 方法的思路，我們必須要檢測到來源于樣品中低聚半乳糖的半乳糖增量，所以如果樣品中游離的半乳糖、乳糖或者含有半乳糖的低聚糖含量非常高，比如說乳制品樣品，就需要解決樣品中游離的半乳糖、乳糖或含有半乳糖的低聚糖的去除問題，而上述研究中都沒有對這一問題進行研究。

3 食品中低聚半乳糖檢測方法的研究方向

由于國際上發(fā)布的低聚半乳糖的檢測方法標準只有AOAC 45.4.12-2001.02《Determination of trans-Galactooligosaccharides（TGOS）in Selected Food Products》，我們國家還沒有發(fā)布低聚半乳糖檢測方法的國家或行業(yè)標準。而其他的研究結(jié)果應用到食品中低聚半乳糖的測定存在較多的不足，所以食品中低聚半乳糖的檢測方法研究最好以AOAC 方法為思路，重點解決以下2 個問題。

3.1 商業(yè)化低聚半乳糖分子的平均聚合度

通過對商業(yè)化低聚半乳糖原料中低聚半乳糖組分結(jié)構(gòu)和比例進行研究，測定并計算低聚半乳糖的平均聚合度，進而計算得到利用半乳糖增量計算低聚半乳糖含量的換算系數(shù)，解決AOAC 方法結(jié)果計算問題。

低聚半乳糖平均聚合度的測定方法主要有高效液相色譜法、離子色譜法和質(zhì)譜法。

HPLC 法可以采用聚合度分析和氨基柱分析，利用面積歸一法計算出低聚半乳糖的平均聚合度。離子色譜法需要選用適合分離低聚糖的色譜柱，把低聚半乳糖原料進行很好的分離，測量每個組分的分子量（或聚合度），然后用面積歸一法計算出低聚半乳糖的平均聚合度。這兩種方法建立在用于研究的低聚半乳糖原料是由純的乳糖轉(zhuǎn)化而來，不能含有乳糖來源的半乳糖、葡萄糖、低聚糖以外的低聚糖，而且每一種低聚半乳糖組分都要很好的分離，還要知道每個組分的聚合度，同時假設(shè)每種組分的響應值相等，存在一定的誤差。

質(zhì)譜法需要對低聚半乳糖每個組分的質(zhì)荷比進行測量，確定不同質(zhì)荷比的離子豐度，通過每個聚合度組分的離子豐度比計算低聚半乳糖的平均聚合度。質(zhì)譜法所研究的對象也應該是由純的乳糖轉(zhuǎn)化而來的低聚半乳糖，不能含有其他來源的低聚糖，還要保證乳糖和低聚半乳糖中的二糖有很好的分離，保證每個聚合度組分的離子豐度響應值相同（最重要的是每個離子的帶電荷數(shù)一定要相等），也存在一定的誤差。

雖然以上測定聚合度的方法都存在一定的誤差，但是通過分析誤差的可接受程度和測定方法的可操作性，應該可以建立與蛋白質(zhì)換算系數(shù)相類似的低聚半乳糖的換算系數(shù)。

3.2 可測定樣品的通用性研究

因為需要通過測定樣品中的半乳糖增量來計算樣品中低聚半乳糖含量，所以樣品中游離的乳糖、半乳糖含量是影響測定結(jié)果準確性的重要因素，因為本底中半乳糖含量太高，通過水解后得到的半乳糖增量相對比例較低，測定誤差就比較大。

研究并解決在樣品前處理中去除游離乳糖、半乳糖的干擾，能夠提高檢測結(jié)果的準確性，提高檢測方法對樣品的通用性，尤其是乳制品樣品?？梢钥紤]通過固相萃取、微生物、色譜制備技術(shù)對樣品中游離的乳糖、半乳糖進行去除。但是因為檢測目標物和乳糖、半乳糖都屬于糖類，結(jié)構(gòu)相同，所以這部分研究將有比較大的難度，并且需要較大的投入。

另外，在樣品前處理過程中還需要考慮樣品中的帶電離子尤其是二價離子對離子色譜柱的影響，需要研究這些離子的去除技術(shù)。

4 結(jié)論

雖然低聚半乳糖的檢測技術(shù)研究有一定的難度，但是隨著人們的生活水平不斷提高，添加低聚半乳糖的食品會越來越受到消費者的重視，開發(fā)生產(chǎn)添加低聚半乳糖的具有益生功能的食品將是發(fā)展趨勢。從當前國內(nèi)的食品質(zhì)量安全形式和消費者對食品質(zhì)量要求的不斷提高，研究開發(fā)食品中低聚半乳糖含量的檢測方法顯得尤為重要。研究開發(fā)并制定食品中低聚半乳糖含量的檢測方法標準，不僅能夠為企業(yè)提供適合的檢測方法，加強產(chǎn)品的生產(chǎn)過程控制；也可以為食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗部門提供檢測方法，并可為食品中其他低聚糖成分的檢測技術(shù)研究提供借鑒。

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