朱淼，李莎，劉志培，白煥麗，孟軻音，李忠義，王雄，萬家余，陳志寶

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所；3.吉林大學(xué)；4.天津大學(xué)）

近年來，神經(jīng)退行性疾病越來越多的受到了人們的關(guān)注，然而，高等動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜多樣，為研究該疾病帶來了很大的困難。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一種經(jīng)典的模式生物，它的出現(xiàn)使得生命科學(xué)等領(lǐng)域許多復(fù)雜問題變得簡單化，對生命科學(xué)的發(fā)展起著舉足輕重的作用。秀麗線蟲成蟲長約1 mm，身體為半透明，以大腸桿菌OP50為食，繁殖速度快，實(shí)驗(yàn)周期短，易在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，對人、動(dòng)物和植物都沒有危害。新秀麗線蟲已經(jīng)被證明能夠系統(tǒng)的研究神經(jīng)功能、行為、年齡以及神經(jīng)退化疾病[1-5]。

1 朊病毒病線蟲模型

1.1 鼠PrP 表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因線蟲運(yùn)動(dòng)、生長的損傷

朊病毒病是一類致死性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，在哺乳動(dòng)物中常見瘋牛病、羊瘙癢癥、鹿慢性消耗病、貓海綿狀腦病以及傳染性水貂腦軟化病等；在人身上則發(fā)現(xiàn)了庫魯病、致死性家族失眠癥、克雅氏病以及格斯特曼綜合癥等[6]。迄今為止，其發(fā)病機(jī)制依然是一個(gè)未解之謎。國內(nèi)外研究人員從不同切入點(diǎn)著手研究，發(fā)現(xiàn)大量與朊蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變、朊病毒致病的相關(guān)重要信息。

朊蛋白有兩種，一種是正常形式的PrPC，一種是致病形式的PrPSC，兩種蛋白的構(gòu)型不同，其理化性質(zhì)也不同，PrPC構(gòu)象改變?yōu)镻rPSC后能引發(fā)人和動(dòng)物朊病毒病。Kyung-Won Park[7]等用沒有致病性的線蟲作為研究朊病毒病模型，他們提取了細(xì)胞形式的鼠朊蛋白（MoPrP），并與CFP 或YFP 融合后（CFP 或YFP是一種指示熒光，證明目的基因成功轉(zhuǎn)入線蟲體內(nèi)），在線蟲的肌細(xì)胞壁上表達(dá)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)朊蛋白（PrP）在神經(jīng)元細(xì)胞的堆積，將會(huì)導(dǎo)致PrPSC類似的分子結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞顯著凋亡[8-9]。此外，提高PrP 水平將會(huì)在其肌細(xì)胞中檢測到肌肉相關(guān)疾病，如人體肌炎，多肌炎，皮肌炎，神經(jīng)源性肌肉萎縮[10]。然而，也有相反的報(bào)道，細(xì)胞形式的PrP 表達(dá)對N2a 細(xì)胞或初期的神經(jīng)元培養(yǎng)沒有毒性[11-12]。

Kyung-Won Park 等人利用轉(zhuǎn)基因線蟲表達(dá)細(xì)胞形式MoPrP，并且出現(xiàn)了一種外形驚人的短粗類型的線蟲。盡管該類型的線蟲潛在機(jī)制還不清楚，但是其異常的肌肉結(jié)構(gòu)及嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)損傷提示我們細(xì)胞形式的MoPrP 堆積，可能對線蟲產(chǎn)生毒性。事實(shí)上，在線蟲的肌細(xì)胞壁上表達(dá)MoPrP（23-231），它能夠模仿啟動(dòng)子unc-54 突變，導(dǎo)致肌細(xì)胞形態(tài)和功能改變，而且這種獲得性的功能顯性可能有助于我們對朊病毒介導(dǎo)毒性的研究。由于MoPrP（23-231）被檢測到對蛋白水解酶K 沒有抵抗作用，所以，在線蟲肌細(xì)胞中產(chǎn)生的MoPrP（23-231）與PrPSC的結(jié)構(gòu)不同[13]。

1.2 在線蟲體內(nèi)PrP 的突變影響蛋白的發(fā)病機(jī)制及細(xì)胞毒性

MoPrP（Q167R）是密碼子的167 位點(diǎn)由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼嵬蛔兊氖驪rP，MoPrP（Q167R）能夠抑制綿羊癢病。人們構(gòu)建了共表達(dá)MoPrP（Q167R）（23-231）-YFP 的線蟲和表達(dá)MoPrP（23-231）-CFP的線蟲。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Q167R 能夠減少在線蟲體內(nèi)PrP 的毒性，其作用機(jī)制還不清楚。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MoPrP（Q167R）（23-231）-YFP 和MoPrP（23-231）-CFP 有共同的表達(dá)位點(diǎn)，這種沒有毒性的低聚體可能是由于PrP（Q167R）影響野生型PrP 的折疊導(dǎo)致的。

總之，線蟲和哺乳動(dòng)物的朊蛋白的折疊是相似的，因此，我們可以用線蟲研究潛在的細(xì)胞機(jī)制。到目前為止，朊蛋白殺死神經(jīng)元的機(jī)制仍是一個(gè)謎。

1.3 突變的Fyn 激酶對朊蛋白秀麗線蟲模型的影響

盡管朊蛋白的傳播途徑已經(jīng)被很好的了解，但是朊蛋白神經(jīng)毒性的信號(hào)肽激活途徑仍然不被了解，Nicolas Bizat 等鑒別了一種Fyn 相關(guān)激酶src-2，其是從插入一段突變的人PrP 中獲得的，該基因在線蟲體內(nèi)產(chǎn)生毒性。轉(zhuǎn)基因PrP 在質(zhì)膜上表達(dá)，部分對蛋白水解酶K（PK）有抵抗作用，突變體PrP 檢測到不溶性的蛋白。src-2 功能的缺失會(huì)降低突變體PrP 的神經(jīng)毒性，而不會(huì)減少PrP 的蛋白水解酶水平。壽命調(diào)節(jié)因子sir-2.1/SIRT1，是一種sirtuin 的去乙?；福鳛榈鞍咨窠?jīng)毒性改變劑，增加sir-2.1 的劑量會(huì)減少PrP 的神經(jīng)毒性，而sir-2.1 功能缺失會(huì)加重神經(jīng)毒性。而且這些影響沒有改變對蛋白水解酶K 的抵抗作用。這些結(jié)果顯示了Fyn 能夠調(diào)節(jié)突變體PrP 的神經(jīng)毒性，sirtuin 的激活能夠減緩神經(jīng)毒性的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sirtuin 能夠治療潛在的蛋白神經(jīng)毒性，并影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

2 帕金森氏病線蟲模型

帕金森綜合癥是一種黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺神經(jīng)功能受損所致多巴胺與乙酰膽堿平衡失調(diào)的一種慢性疾病，帕金森病是屬于α-共核蛋白錯(cuò)誤折疊性神經(jīng)退行性疾病，其病理改變主要為蒼白球或殼核部位中的細(xì)胞出現(xiàn)病變。以運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫和強(qiáng)直為主要特征。在LRRK2 的突變常常發(fā)生在常染色體顯性遺傳和原發(fā)性帕金森疾?。≒D），這些突變普遍發(fā)生在GTP 酶（R1441C/G）和激酶（G2019S）區(qū)域。體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，R1441C 和G2019S 突變與激酶活性增加相關(guān)。這些LRRK2 基因蛋白的過度表達(dá)導(dǎo)致年齡依賴性的多巴胺神經(jīng)元退行性變，行為異常，運(yùn)動(dòng)功能障礙，并伴隨著體內(nèi)多巴胺水平的減少。相比之下，R1441C 和G2019S 突變導(dǎo)致比野生型蛋白更嚴(yán)重的表型。

Chen Yao 和Rabih El Khoury[14]等構(gòu)建了多巴胺神經(jīng)元表達(dá)人野生型LRRK2 基因和兩個(gè)多巴胺相關(guān)的突變基因R1441C 和G2019S。這些轉(zhuǎn)基因線蟲有多巴胺方面的病理學(xué)特征，包括成人進(jìn)行性神經(jīng)退化，運(yùn)動(dòng)功能障礙并伴隨著多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的缺失。這些不正常的現(xiàn)象可以被外源多巴胺治療。因此，LRRK2 轉(zhuǎn)基因線蟲對于體外研究LRRK2 與多巴胺是非常有用的，而且預(yù)示著對多巴胺發(fā)病機(jī)制的破解。

從該線蟲模型中可以得到一些啟示：第一，野生型LRRK2、R1441C 和G2019S 過度表達(dá)，將會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)退化，并伴隨著運(yùn)動(dòng)障礙和多巴胺的耗竭。LRRK2 和多巴胺相關(guān)突變基因R1441C 和G2019S的病理學(xué)顯性顯示出更嚴(yán)重的損傷。這些結(jié)論證明：多巴胺相關(guān)突變基因R1441C 和G2019S 能夠獲得一個(gè)有害的功能，誘導(dǎo)神經(jīng)退化和功能缺失。第二，在線蟲體內(nèi)，不激活LRRK2 活性，而K1347A 突變，表現(xiàn)出抑制LRRK2 誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)退化和行為缺失。這是由于K1347A 突變能夠直接損害GTP 和GTPase 的區(qū)域，隨之而來的是LRRK2 激酶的活性不被激活[15-19]。

該實(shí)驗(yàn)的研究人員認(rèn)為人們可以利用目前的線蟲模型作為一個(gè)平臺(tái)，幫助人們研究體外突變的影響和發(fā)病機(jī)制，結(jié)果顯示線蟲內(nèi)源LRK-1 的缺失能夠抑制LRRK2 誘導(dǎo)的顯型，也能抑制CAT-2 過度表達(dá)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。此外，已有報(bào)道，在果蠅中野生型LRRK2 和G2019S 的過度表達(dá)能夠誘導(dǎo)神經(jīng)退化[20]，在LRRK2 突變的轉(zhuǎn)基因鼠模型中發(fā)現(xiàn)鼠變得聰明，R1441C 突變的轉(zhuǎn)基因鼠表現(xiàn)出正常的行為，而且沒有神經(jīng)退化[21]。在哺乳動(dòng)物模型中，這些LRRK2 相關(guān)的多巴胺線蟲模型對于臨床研究LRRK2 治療多巴胺疾病是非常有用的工具。

3 阿爾茨海默病線蟲模型

阿爾茲海默?。ˋlzheimers disease，AD）是發(fā)病率最高的神經(jīng)退行性病變，其主要是由于β-淀粉樣蛋白錯(cuò)誤折疊引起的，是老年癡呆的一種，多發(fā)生于中年或老年早期。1995年，Link[22]將貝塔淀粉樣多肽（1-42）（Abeta1-42）肽段編碼基因轉(zhuǎn)基因到秀麗隱桿線蟲的肌細(xì)胞，線蟲肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了硫黃素S（thioflavins S）陽性反應(yīng)沉淀物和進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)麻痹的表型，這是第一個(gè)AD 的線蟲模型。研究表明阿爾茲海默病主要成分是貝塔淀粉樣多肽（1-42）（Abeta1-42），Abeta1-42 與該病發(fā)生緊密相關(guān)[23-24]。

有研究報(bào)道銅離子參與了AD 的病理發(fā)生[25]，該線蟲模型主要用于研究Abeta1-42 與銅的相互作用及其產(chǎn)生的毒性。研究人員將線蟲分別暴露于3 種不同濃度的銅離子（終濃度分別為10-3，10-4，10-6mol·L-1），結(jié)果顯示，隨著銅離子濃度增加，線蟲癱瘓行為也顯著增加，這表明在AD 的發(fā)病過程中，銅離子影響了Abeta1-42 的毒性發(fā)揮。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)銅會(huì)改變線蟲體內(nèi)金屬元素的穩(wěn)態(tài)平衡。這是由于Abeta1-42 與銅共同作用，改變了基因sod-1，prdx-2，skn-1，hsp-60，和hsp-16.2 的表達(dá)水平，引起活性氧堆積，導(dǎo)致線蟲癱瘓。這些研究結(jié)果將為理解AD患者的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)異常和功能障礙提供重要線索。

4 結(jié)論與展望

近年來，隨著人們對線蟲模型研究日益深入，秀麗隱桿線蟲因其獨(dú)特的優(yōu)勢，使之成為生物學(xué)家借以了解諸多基本生命現(xiàn)象的首選模型。通過轉(zhuǎn)基因、突變體篩選等方法，人們已成功制備秀麗隱桿線蟲的幾種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病模型。研究秀麗隱桿線蟲基因功能時(shí)，可以將綠色熒光蛋白與目的基因融合，幫助人們推斷與之緊密相連的目的基因篩選的時(shí)間、表達(dá)的部位和表達(dá)數(shù)量的多少，便于觀察。由于新秀麗線蟲與人類的某些調(diào)控機(jī)制的相似性及其結(jié)構(gòu)的簡單性，可以利用秀麗線蟲作為動(dòng)物模型進(jìn)行藥物篩選。此外，秀麗線蟲還可以在藥物新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，藥物機(jī)制研究，人類疾病模型的復(fù)制及藥物干預(yù)，化學(xué)基因組和毒理學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[26]?？梢灶A(yù)見，在不久的將來，使用秀麗隱桿線蟲開創(chuàng)的神經(jīng)退行性疾病機(jī)理的研究，將能在攻克各種未解決的疾病方面發(fā)揮重要作用。通過研究線蟲的神經(jīng)退行性疾病模型的調(diào)控機(jī)制，并將其成果應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，對延長人的壽命及提高人的生活質(zhì)量有很大意義。

短短幾十年中，以秀麗線蟲為研究對象取得的科研成果層出不窮，線蟲已成為當(dāng)代生命科學(xué)研究中的一個(gè)重要的模式生物。相信隨著研究的深入，秀麗線蟲將會(huì)為人類生命科學(xué)的探索做出更大的貢獻(xiàn)。

［1］Thomas JH.Nematodes are smarter than you think［J］.Neuron，2001，30: 7-8.

［2］Carter CS，Ramsey MM，Sonntag WE.A critical analysis of the role of growthhormone and IGF-1 in aging and lifespan［J］.Trends Genet，2002，18: 295-301.

［3］Goedert M.Neurodegenerative tauopathy in the worm［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003，100: 9653-9655.

［4］Hsu AL，Murphy CT，Kenyon C.Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor［J］.Science，2003，300: 1142-1145.

［5］Morley JF，Morimoto RI.Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones［J］.Mol Biol Cell，2004，15: 657-664.

［6］Prusiner SB.Prion diseases and the BSE crisis［J］.Science，1997，278: 245-251.

［7］Kyung-Won Park.Cytoplasmic expression of mouse prion protein causes severe toxicity in Caenorhabditis elegans［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，372: 697-702.

［8］Ma J，Lindquist S.De novo generation of a PrPSc-like conformation in living cells［J］.Nat.Cell Biol，1999（1）:358-361.

［9］Ma J，Wollmann R，Lindquist S.Neurotoxicity and neurodegeneration when PrP accumulates in the cytosol［J］.Science，2002，298: 1781-1785.

［10］Zanusso G，Vattemi G，F(xiàn)errari S，et al.Increased expression of the normal cellular isoform of prion protein in inclusion-body myositis，inflammatory myopathies and denervation atrophy［J］.Brain Pathol，2001（11）:182-189.

［11］Fioriti L，Dossena S，Stewart LR，et al.Cytosolic prion protein （PrP）is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations ［J］.Biol Chem ，2005，280: 11320-11328.

［12］Roucou X，Guo Q，Zhang Y，et al.Cytosolic prion protein is not toxic and protects against Bax-mediated cell death in human primary neurons ［J］.Biol Chem，2003，278: 40877-40881.

［13］Chiesa R，Pestronk A，Schmidt RE，et al.Primary myopathy and accumulation of PrPSc-like molecules in peripheral tissues of transgenic mice expressing a prion protein insertional mutation［J］.Neurobiol.Dis，2001（8）:279-288.

［14］Chen Yao，Rabih El Khoury.LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson’s disease［J］.Neurobiology of Disease，2010，40:73-81.

［15］Guo L，Gandhi PN，Wang W，et al.The Parkinson’s disease-associated protein，leucine-rich repeat kinase 2（LRRK2），is an authentic GTPase that stimulates kinase activity［J］.Exp Cell Res，2007，313: 3658-3670.

［16］Ito G，Okai T，F(xiàn)ujino G，et al.GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2，a causative gene product for familial Parkinson’s disease［J］.Biochemistry：Mosc，2007，46: 1380-1388.

［17］Li X，Tan YC，Poulose S，et al.Leucine-rich repeat kinase 2 （LRRK2）/PARK8 possesses GTPase activity that is altered in familial Parkinson’s disease R1441C/G mutants［J］.Neurochem，2007，103: 238-247.

［18］Smith WW，Pei Z，Jiang H，et al.Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity ［J］.Nat Neurosci，2006（9）: 1231-1233.

［19］West AB，Moore DJ，Choi C，et al.Parkinson’s diseaseassociated mutations in LRRK2 link enhanced GTP -binding and kinase activities to neuronal toxicity［J］.Hum Mol Genet，2007，16: 223-232.

［20］Liu Z，Wang X，Yu Y，et al.A Drosophila model for LRRK2-linked parkinsonism ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105: 2693-2698.

［21］Tong Y，Pisani A，Martella G，et al.R1441C mutation in LRRK2 impairs dopaminergic neurotransmission in mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106: 14622-14627.

［22］Link CD.Invertebrate models of Alzheimer’s disease［J］.Genes Brain Behav，2005（4）: 147-156.

［23］Mattson MP.Pathways towards and away from Alzheimer’s disease［J］.Nature，2004，430: 631-639.

［24］Goedert M，Spillantini MG.A century of Alzheimer’s disease［J］.Science，2006，314: 777-781.

［25］Bush AI.The metallobiology of Alzheimer’s disease［J］.Trends Neurosci，2003，26: 207-214.

［26］楊再昌，楊小生． 秀麗隱桿線蟲在藥物篩選中的應(yīng)用［J］．生命科學(xué)．2009，21（4）：593-598．