北京天壇生物制品股份有限公司（100024）孫旭東 陳更新

保護劑是凍干活疫苗中不可或缺的一部分。保護劑作用有以下幾點：①具有保護病毒及細菌活力、抗原穩(wěn)定性、耐干燥和冷凍的低分子物質和形成凍干活疫苗耐熱性結構的有機高分子物質；②具有高度抗氧化作用的抗氧化劑，能夠最大限度地消耗溶液中溶解的氧，減少病毒或細菌與氧的接觸，降低病毒或細菌的代謝活力和能量損耗，防止其在冷凍干燥及儲運過程中死亡；③根據(jù)保護劑中的每一種物質的共融點進行大量反復凍干試驗，科學地確定每一種活疫苗的凍干曲線，使病毒或細菌在凍干過程中的失活率降到最低程度，也使凍干活疫苗形成良好的物理性狀。

1 冷凍干燥技術介紹

冷凍干燥技術是目前保持微生物、動物組織、細胞及蛋白質等活性物質生物活性的一個有效的、普遍的方法。在一定的真空條件下，制品溶液預先凍結成固體，然后在低溫低壓條件下，從凍結狀態(tài)不經(jīng)過液態(tài)而直接升華除去水分的一種干燥方法。此過程即稱為冷凍干燥，簡稱凍干，是冷凍和干燥的結合[1]。

2 冷凍干燥對疫苗的損傷

在真空冷凍干燥過程中，冷凍和干燥不可避免地會造成部分微生物細胞的損傷及死亡，導致蛋白質變性[2]。為提高和保證凍干活疫苗的存活率與生物活性，人們進行了大量的研究，其中包括凍干過程中蛋白質的空間結構變化，各種保護劑對蛋白質的影響。蛋白質的折疊與展開狀態(tài)的平衡受周圍物理環(huán)境（例如pH值、溫度、溶劑成分、水合水平等）的影響很大。

從二十世紀六、七十年代開始，國外一些學者對凍干蛋白質的變性機理進行研究，當時認為變性主要發(fā)生在冷凍過程。從二十世紀八、九十年代至今，普遍認為在冷凍干燥過程中，冷凍和干燥都會引起蛋白質變性[3]。冷凍變性機理是冷凍過程中結晶引起水的狀態(tài)和結構的變化，是蛋白質變性的主要原因，并且蛋白質變性的程度依賴于冷凍的程度，冷凍溫度越低，蛋白質變性越劇烈。在低溫下有序的水的結構引起蛋白質分子中疏水鍵的破壞是導致蛋白質變性的主要原因。蛋白質分子周圍分布著多層水分子，在降溫過程中，蛋白質分子周圍的水分子不斷凍結，但只要蛋白質分子表面的單層水分子沒有凍結，蛋白質就不會變性，反之亦然。干燥變性機理是干燥過程的變性，主要是發(fā)生在二次干燥階段即移去結合水的階段。蛋白質在水溶液中是水化的，表面有一層水分子包圍，構成一個單層分子，這就是水化層。這層水分子通過氫鍵和蛋白質相互作用連接。干燥過程要移去一部分水化層的水，破壞蛋白質表面的氫鍵結構，引起天然結構的變性。

3 保護劑作用機理

凍干活疫苗的整個凍干過程存在著各種各樣的應力，通常包括低溫應力、凍結應力（包括枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、pH值的改變、相分離等）、干燥應力（移去蛋白質表面單層水分子）等，這些應力常常是直接或間接導致生物制品不穩(wěn)定的因素[4]。保護劑可以改變疫苗冷凍干燥時的物理、化學環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持生物樣品原有的各種理化特性和生物活性，同時對產(chǎn)品貯藏期內(nèi)蛋白質變性起到抑制作用[5]。

4 保護劑介紹

常用在凍干活疫苗中的保護劑種類有：多羥基化合物、糖、蛋白質、聚合物、氨基酸、鹽、表面活性劑等。

4.1多羥基化合物 多羥基化合物是保護劑中重要成分之一，常見的有甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、側金盞花醇等[6]。多羥基化合物的保護機理：由于疫苗蛋白質分子中存在大量的氫鍵，結合水通過氫鍵與蛋白質分子連接，當凍干過程中脫水后，多羥基化合物的羥基能替代蛋白質表面的水分子的羥基，與蛋白質表面形成一層假定的水化膜，從而保護氫鍵的連接位點不直接暴露在周圍環(huán)境中，穩(wěn)定蛋白質的高級結構，防止蛋白質因凍干而變性。

4.2糖 糖是凍干活疫苗中最常見的保護劑，使用最廣的一類必要成分，為蛋白質的非特異性穩(wěn)定劑。在凍干及保存各階段均能對生物制品起到一定的保護作用。糖的保護作用與其及蛋白質的種類有關[7]。常見的有蔗糖、乳糖、海藻糖、菊糖、糊精等。糖的保護作用：二糖對阻止蛋白質二級結構的改變、凍干處理過程中及貯藏期內(nèi)蛋白質多肽鏈的伸展和聚集起著顯著作用。二糖中的蔗糖和海藻糖是研究最多、也是公認最有效的保護劑。

4.3蛋白質 蛋白質保護劑是保護劑的重要組分。蛋白質類保護劑根據(jù)來源可分為兩種：動物源性蛋白質和外來蛋白質。血清白蛋白是一個經(jīng)典-優(yōu)良的蛋白質穩(wěn)定劑，人血清白蛋白則在更低濃度（＜0.05%～0.1%）時能有效阻止蛋白質表面的吸附，對凍干過程中多數(shù)蛋白都具有保護作用。目前，也有報道稱重組人白蛋白推薦為血清白蛋白的替代品[8]。

4.4聚合物 聚合物作為大分子物質保護劑，要與小分子物質聯(lián)合使用，常見的有聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明膠、聚乙烯亞胺。通常聚合物的穩(wěn)定作用取決于聚合物的多重性質，如優(yōu)先從蛋白質表面析出、表面活性、使蛋白質溶液濃度升高從而阻止其他小分子（如糖及多羥基化合物）的結晶、抑制冷凍過程中pH值的劇烈變化等。

4.5氨基酸 氨基酸是蛋白質保護劑常見的一種，常用的氨基酸類保護劑有精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸等。在冷凍過程中的主要作用是能升高成品的塌陷溫度，阻止因塌陷而引起蛋白質結構的破壞[9]。

5 保護劑的選用

要想獲得穩(wěn)定的活疫苗凍干制品，保護劑的選用至關重要。保護劑的選取對提高其穩(wěn)定性尤為重要。一個優(yōu)良的保護劑要對保持疫苗的玻璃化有利，因為玻璃化的疫苗不僅復溶速率高，物理性狀好，而且質量穩(wěn)定性高。要對被保護的疫苗物理化特性有了解，通過試驗摸索出在凍干過程及貯藏過程中導致該疫苗不穩(wěn)定的因素。然后針對這些不穩(wěn)定性因素選擇具體的保護劑。大量實驗證明，糖及多羥基化合物是最常用的保護劑。其中蔗糖對一些蛋白質能顯示出很好的保護作用，故在選取保護劑時要優(yōu)先考慮。使用任何一種保護劑不能對活疫苗起到所有的保護，因此還得考慮兩種或兩種以上的保護劑的使用。在考慮使用多種保護劑時，不同種類的保護劑能起到顯著的保護效果。此外，原輔材料的選購、配制、滅菌、保存和使用，對于凍干活疫苗的質量起著至關重要的作用，如在保護劑配制過程中，使用不同廠家生產(chǎn)的原材料進行活疫苗的凍干，結果可導致疫苗在耐老化試驗后效力檢驗達不到質量標準的要求。此外，原輔材料中的雜質也會對凍干活疫苗的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。保護劑通常有一個最佳的使用濃度，所以需要摸索合理的配比使用量。保護劑的配制對活疫苗的穩(wěn)定性同樣有重要作用。在配制過程中應注意以下幾點：①配制用水的標準；②稱量的準確度；③保護劑的溶解順序；④大分子物質與小分子物質混合比例；⑤保護劑貯存溫度。以上任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都可能會影響保護劑的性能，導致保護劑失去保護病毒的作用，從而導致活疫苗質量的不穩(wěn)定。

6 小結

在凍干前，疫苗要經(jīng)過配液、過濾及分裝等過程，期間疫苗處于水溶液這一相對不穩(wěn)定狀態(tài)，即使相對較短時間，也可能發(fā)生降解反應。因此應加快各操作步驟，盡量縮短該過程持續(xù)時間，以防溶質發(fā)生沉淀，進而導致疫苗穩(wěn)定性降低。

保護劑因其獨特的生產(chǎn)工藝條件，為許多活疫苗特別是對溫度敏感的抗原和水溶液中不穩(wěn)定的抗原提供了穩(wěn)定的制備方法，發(fā)展十分迅速。但冷凍干燥是一個伴隨有熱質轉換發(fā)生的非常復雜的物理化學變化過程，在凍干過程中冷凍濃集引起的高鹽濃度、pH值變化和干燥失水引起的表面作用都會對疫苗抗原結構穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。除此以外，對疫苗穩(wěn)定性有重要影響的因素還有水分含量、保護劑結晶等。

為了提高活疫苗的穩(wěn)定性，對凍干生產(chǎn)工藝和保護劑選擇進行了大量的研究，其中保護劑的選取對提高其穩(wěn)定性尤為重要。一個優(yōu)良的保護劑要對保持疫苗的玻璃化有利，因為玻璃化的疫苗不僅復溶速率高，物理性狀好，而且質量穩(wěn)定性高。目前，已掌握了一些保護劑的作用機制，但不同的抗原穩(wěn)定性不同。仍需要進一步深入研究保護劑機理，最終提供滿足不同條件的有效穩(wěn)定的保護劑，為生產(chǎn)出質量合格穩(wěn)定的凍干活疫苗提供保障。