王 珍，尤其嘉，楊靖亞，晁若瑜

（上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

鎘被美國毒物管理委員會（ATSDR）列為第6位危及人體健康的有毒物質(zhì)[1]。曾明等[2]研究表明，鎘對動物的腎臟、肝臟都有不同程度的損害。陳敏等[3]研究表明，鎘有明顯的肝臟毒性。在實驗研究之后，由于不再接觸鎘，肝臟作為解毒器官，肝臟功能會不同程度的恢復(fù)。Tahiri等[4]研究表明，果膠多糖對鉛的吸收有阻礙作用。劉培勛等[5]發(fā)現(xiàn)銀耳堿提多糖有一定清除自由基的能力。多糖的解毒作用可能與自由基的清除有關(guān)。張國升等[6]探討了蘆根多糖對四氯化碳小鼠肝損傷的保護作用。李立華等[7]研究發(fā)現(xiàn)蘆根多糖大、小劑量對模型大鼠血清AST含量均有降低作用，且多糖小劑量對白蛋白與球蛋白（A/G）比值也可起到升高作用。目前，蘆根多糖對鎘中毒的研究甚少，本實驗將探討蘆根多糖對鎘中毒引起的小鼠肝和腎組織的損傷的保護作用，以期為蘆根多糖的開發(fā)利用和鎘中毒的治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆根 北京永安堂藥店；丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所，20110711；高錳酸鉀、硫酸鋁鉀、蘇木素、伊紅、甘油、甲醛 國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純；SPF級健康昆明小白鼠50只 上海第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，18～22g。

LEICA RM2245切片機、LAICA HI1220烘片機、BM1000顯微鏡、TGL-20C冷凍離心機、UV1102紫外風(fēng)光光度計 上海圣科儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆根多糖的制備 按照本實驗室的提取方法[8]，先將蘆根粗提取，采用Sevag法去蛋白，選取1.6cm×40cm凝膠層析柱進行分離純化，冷凍干燥得到的蘆根多糖（包括三種多糖：R-PolyⅠ、R-PolyⅡ和R-PolyⅢ）備用。

1.2.2 動物模型建立與灌胃解毒 SPF級健康昆明小白鼠50只，飼養(yǎng)一周。將小白鼠分為5組：正常組、模型組、多糖高劑量組、多糖中劑量組和多糖低劑量組。每組10只，雌雄各半。模型組、多糖高劑量組、多糖中劑量組和多糖低劑量組腹腔注射氯化鎘溶液2.5mg/（kg·d）；每周連續(xù)4d，連續(xù)5周[9]。

造模結(jié)束后，多糖高劑量組每天灌胃蘆根多糖480mg/（kg·d），多糖中劑量組灌胃240mg/（kg·d），多糖低劑量組灌胃120mg/（kg·d）[7]，共連續(xù)灌胃20d。正常組和模型組小鼠正常飼喂，正常飲水。

1.2.3 老鼠組織的表征觀察 實驗結(jié)束后，各組老鼠禁食12h，解剖，觀察肝臟和腎臟的病變。

1.2.4 肝臟和腎臟組織的重量變化 老鼠禁食12h，解剖取肝臟和腎臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水清洗干凈，濾紙吸去多余水分，稱量各組織塊重量及體重，計算肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)（見表1）。

1.2.5 肝腎組織石蠟切片 取解剖后的部分肝組織和腎組織，用冰生理鹽水清洗干凈血跡，濾紙吸干水分，將組織塊切成大小為0.5×0.5cm2的小方塊，制得切片，將玻片置于顯微鏡下觀察拍照，進行病理形態(tài)學(xué)檢查。

1.2.6 肝腎組織的丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量的測定 將小鼠肝、腎組織分別用生理鹽水漂洗脫血后制成10%的肝組織和腎組織勻漿，將制備好的勻漿用冷凍離心機離心10min（2000r/min），勻漿離心好后棄下面沉淀，留上清做后續(xù)的測定[10]。

1.2.6.1 肝腎組織的丙二醛（MDA）含量的測定 按試劑盒說明書進行測定，求得MDA的含量（見表2、表3）。

1.2.6.2 肝腎組織中的谷胱甘肽（GSH）含量的測定取待測肝、腎組織勻漿0.5mL，按試劑盒說明書進行測定，求得GSH的含量（見表2、表3）。

1.2.6.3 肝腎組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量的測定 將10%的肝組織和腎組織勻漿稀釋至最佳濃度，按試劑盒說明書進行GSH-Px活性測定（見表2、表3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織和腎臟組織的表征觀察

多糖灌胃結(jié)束后，小鼠禁食12h解剖觀察其肝臟和腎臟組織。正常組中小白鼠的肝臟和腎臟組織顏色均呈紅褐色，組織質(zhì)地均勻且邊緣銳利，被膜光滑有光澤。模型組每只小鼠的肝臟和腎臟均呈土黃色，邊緣鈍圓，臟器無光澤且腫大。多糖低中劑量組小白鼠的肝臟和腎臟均呈土黃色，邊緣鈍圓，臟器無光澤且腫大。多糖高劑量組小白鼠的肝臟腎臟略見腫大，邊緣稍有鈍圓，組織顏色依舊呈紅褐色。

2.2 肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)

各組小白鼠解剖后的肝臟和腎臟，用電子天平稱量濕重量，以小鼠肝臟重量、腎臟重量與其體重之比，分別記算肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)（見表1）。從表1中可以看出，模型組小鼠的肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)較正常組大。多糖三劑量組中，多糖高中劑量組可不同程度的緩解肝臟、腎臟損傷。

2.3 肝臟組織和腎臟組織的石蠟切片

各組小白鼠肝臟組織病理切片經(jīng)40倍顯微鏡觀察結(jié)果見圖1～圖5。從圖1～圖5中可見，正常組小白鼠的肝細(xì)胞緊密的排列在一起，細(xì)胞核的輪廓比較清楚，肝血竇成放射狀并且走向比較清晰。模型組小白鼠的肝細(xì)胞則多腫脹壞死，細(xì)胞核染色較淡或沒有顏色，肝血竇的走向混亂。多糖低劑量組和中劑量組小白鼠的肝細(xì)胞有部分腫脹壞死，細(xì)胞輪廓難以觀察清楚，細(xì)胞核染色也較淡。多糖高劑量組小白鼠的肝細(xì)胞則稍優(yōu)于低、中劑量組的，肝細(xì)胞腫脹壞死的情況極少，可觀察到細(xì)胞輪廓，且肝血竇的走向清晰呈放射狀。

各組小白鼠腎臟組織的病例切片見圖6～圖10。由圖6～圖10可見，正常組小白鼠的腎細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核可明顯觀察到，且核大小均一。模型組小白鼠的腎小管上皮細(xì)胞多腫脹壞死，細(xì)胞間的間隙變大。多糖低、中劑量組小鼠的腎小管上皮細(xì)胞大部分也都腫脹壞死，細(xì)胞間隙也逐漸變大。而多糖高劑量組小鼠的腎小管上皮細(xì)胞雖有少數(shù)腫脹情況發(fā)生，但卻排列依然緊密，細(xì)胞之間的間隙沒有多糖低、中劑量組的大。

2.4 肝臟和腎臟組織的MDA、GSH、GSH-Px含量

各藥物組對鎘中毒小鼠的肝損傷和腎損傷的保護作用見表2、表3。由表2、表3可知，模型組小鼠肝組織和腎組織中MDA的含量明顯高于正常組，GSH和GSH-Px的含量與正常組相比則極低。說明鎘中毒小鼠模型建立成功。模型組小鼠肝組織、腎組織中的MDA、GSH和GSH-Px的含量是五個組中最高的；正常組肝組織、腎組織中的MDA、GSH和GSH-Px的含量則是五個組中最小的。蘆根多糖高、中、低三劑量組小鼠肝和腎組織中的MDA含量高于正常組，低于模型組；GSH和GSH-Px的含量處于正常組和模型組之間，這說明不同濃度的蘆根多糖對鎘引起的小鼠肝、腎損傷均具有不同程度的保護作用，且呈濃度依賴性。其中，蘆根多糖高劑量組小鼠的各項指標(biāo)極接近正常組，其對小鼠的組織損傷保護作用最有效。

3 結(jié)論與討論

本文通過動物建模探究蘆根多糖對鎘中毒的肝腎的解毒作用。蘆根多糖對鎘中毒小鼠的肝腎損傷的保護作用可能與蘆根多糖的抗氧化性有關(guān)。鎘通過與酶類巰基結(jié)合或替代作用，置換出細(xì)胞內(nèi)酶類金屬，降低機體抗氧化酶的活性，使機體清除自由基的能力下降，引起氧化損傷[11]。肝臟和腎臟是機體重要的代謝解毒器官，在機體代謝過程中，門靜脈收集自腹腔流來的血液，血中的有害物質(zhì)及微生物抗原性物質(zhì)，將在肝內(nèi)被解毒和清除。谷胱甘肽（GSH）是一種天然含巰基三肽，是機體內(nèi)極為重要的抗氧化劑和自由基清除劑，可以和自由基、重金屬等結(jié)合，將毒物轉(zhuǎn)化為無害物而排出體外，使肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性增加，保護肝細(xì)胞膜，促進肝臟酶的活性，促進肝臟的解毒與合成功能[12]。GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，它的生理功能是以GSH為基質(zhì)來促進過氧化物的分解，從而起到抗氧化的作用。因此GSH-Px活性高低意味著機體清除氧自由基的能力的強弱。MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物，其水平的高低體現(xiàn)了自由基的產(chǎn)生情況以及機體抗氧化系統(tǒng)的功能狀態(tài)。

蘆根多糖（R-PolyⅠ、R-PolyⅡ和R-PolyⅢ）組成為阿拉伯糖、葡萄糖、木糖，具有很強的抗氧化活性，具有清除生物體內(nèi)自由基的作用。實驗結(jié)果顯示，蘆根多糖能夠增加GSH的含量，提高機體內(nèi)GSH-Px的活力，使機體的自由基防御處于較高水平，增強機體細(xì)胞的防御機制和解毒作用，機體的防御機制增強，抗氧化作用增強，那么細(xì)胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基將被及時清除，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量自然降低。病理學(xué)形態(tài)切片顯示，不同劑量的蘆根多糖對肝腎細(xì)胞有一定的保護作用。本實驗中蘆根多糖對鎘中毒小鼠的肝腎器官的保護作用可能與其抗氧化作用有關(guān)，這將為蘆根多糖的開發(fā)利用和鎘中毒的治療提供一定的參考依據(jù)。

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