王 瑛，張本印，牛江進(jìn)，張 琳，陶燕鐸，梅麗娟，王啟蘭，*

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810008；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049）

乳白香青（Anaphalis lactea Maxim.）屬菊科香青屬多年生草本植物，主要分布于青海東部、甘肅南部及四川西北部，為常用藏藥，全草用藥，具有活血散瘀、祛風(fēng)濕、消痞瘤、平肝潛陽、祛痰、平喘及外用止血、治風(fēng)寒感冒、胃潰瘍等功效[1-4]。綠原酸是乳白香青中主要的生物活性物質(zhì)之一，化學(xué)名稱為3-咖啡酰奎尼酸，分子式為C16H18O9[5]。綠原酸具有較強(qiáng)的生理活性，如抗腫瘤、抗氧化[6-8]、抗病毒[9]、消炎[10]、解毒、利膽、降壓降血脂和升高白細(xì)胞及顯著增加胃腸蠕動(dòng)和促進(jìn)胃液分泌等藥理作用[11-13]，對(duì)大腸桿菌、金色葡萄球菌、肺炎球菌和病毒有較強(qiáng)的抑制作用[14-15]。綠原酸作為極具生物活性的天然物質(zhì)，目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日化等行業(yè)。我國雖然擁有富含綠原酸的金花、杜仲等豐富的自然資源，國內(nèi)外對(duì)綠原酸的需求仍然較大。但截至目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)還沒有對(duì)乳白香青中綠原酸提取工藝研究報(bào)道。鑒于響應(yīng)面法在優(yōu)化反應(yīng)條件、研究各因素之間相互作用的過程中具有直觀、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，如張崟等[16]就響應(yīng)面法與正交實(shí)驗(yàn)對(duì)骨素酶解工藝做了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)響應(yīng)面法得出的最優(yōu)工藝所得的水解度比正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)工藝所得水解度高出15.4%。將響應(yīng)面法用于乳白香青綠原酸提取工藝的優(yōu)化和結(jié)果分析，對(duì)開發(fā)和利用乳白香青資源有重要意義。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇提取溫度、液料比、甲醇百分含量3個(gè)主要因素，用綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以綠原酸得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對(duì)乳白香青中綠原酸提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳白香青 2011年8月采自青海省門源縣仙米林場(chǎng)（N37°23’～37°50’，E101°46’～102°39’之間），經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生研究所梅麗娟高級(jí)工程師鑒定為乳白香青（Anaphalis lactea Maxim.）；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 購自中國藥品生物制品檢定所；試劑 除高效色譜流動(dòng)相用色譜純外，其余均為分析純；色譜用水 超純水。

Agilent 1200型液相色譜儀 美國安捷倫儀器有限公司；XS105DU型電子天平 瑞士梅特勒托利多；DFY－300型高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；UPT－Ⅰ－57型優(yōu)普超純水機(jī) 成都超純水科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將乳白香青置于通風(fēng)避光處陰干至恒重，用中藥粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉，過八十目篩，備用。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Phenomenex ODS（150.0mm×4.6mm，35μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈－0.3%磷酸（13∶87，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm；柱溫為25℃；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為10μL。

1.2.3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取綠原酸對(duì)照品2.4mg，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得0.24mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。在液相中綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量分別為5、8、10μL，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得線性回歸方程為：y=0.0004x－0.0088，r=0.9998，如圖1所示。結(jié)果表明，峰面積與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量線性關(guān)系良好。綠原酸對(duì)照品色譜圖及乳白香青樣品色譜圖如圖2所示。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在進(jìn)行響應(yīng)面分析之前，先通過單因素實(shí)驗(yàn)選出對(duì)乳白香青綠原酸提取得率有影響的因素，并確定其實(shí)驗(yàn)水平。參考相關(guān)文獻(xiàn)，本文稱取1.00g乳白香青粉末，考察了不同的液料比（10∶1～50∶1）、提取溫度（30～90℃）、甲醇提取濃度（45～95%）、超聲時(shí)間（5～30min）對(duì)綠原酸提取得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析方法 根據(jù)Box－Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇影響乳白香青綠原酸得率（Y）的3個(gè)主要影響因素：提取溫度（A）、液料比（B）、甲醇濃度（C）進(jìn)行組合。以－1、0、1代表自變量水平，xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實(shí)值；其關(guān)系為xi=（Xi－X0）/ΔX。其中，X0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值；ΔX為自變量的變化步長(zhǎng)[17]。實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)綠原酸提取率的影響 設(shè)定甲醇濃度為70%，提取溫度為50℃，考察液料比對(duì)綠原酸提取率的影響。設(shè)計(jì)液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1。結(jié)果如圖3所示。當(dāng)料液比為30∶1時(shí)，綠原酸提取得率基本不再增加。再增加液料比，綠原酸提取得率基本穩(wěn)定，但同時(shí)會(huì)增加生產(chǎn)成本。

2.1.2 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響 設(shè)定液料比20∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，考察提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響。設(shè)計(jì)提取溫度為30、40、50、60、70、80、90℃。結(jié)果如圖4所示，綠原酸提取率溫度升高而增加，當(dāng)溫度升高至?xí)r40℃，綠原酸提取得率最高；40～60℃時(shí)綠原酸提取率平穩(wěn)；隨后提取率急劇降低。

2.1.3 甲醇濃度對(duì)乳白香青中綠原酸提取率的影響設(shè)定液料比20∶1，提取溫度50℃，考察甲醇濃度對(duì)綠原酸提取率的影響。設(shè)計(jì)甲醇體積分?jǐn)?shù)為45%、55%、65%、75%、85%、95%，結(jié)果如圖5所示。綠原酸提取率隨甲醇濃度增加而增加，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，綠原酸提取率最高，甲醇濃度大于65%時(shí)，綠原酸提取得率下降。

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

對(duì)乳白香青中綠原酸提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，其具體實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

采用Design-Expert 8.05軟件對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合，得到綠原酸得率回歸方程：

Y=5.26+0.18A+0.38B+0.17C+0.094AB+0.13AC+0.23BC-0.46A2-0.54B2-0.48C2-0.080A2B。

模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察（見表3）。結(jié)果表明對(duì)綠原酸提取量所建立的二次多項(xiàng)模型具有顯著性。因而該模型擬合程度比較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)甲醇提取乳白香青中綠原酸的提取量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模型方程回歸系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)（見表3）。結(jié)果表明，一次項(xiàng)A、C顯著，B極顯著；二次項(xiàng)A2、B2和C2極顯著；交互項(xiàng)AB、AC不顯著，BC顯著。

2.3 響應(yīng)面分析和因素間的交互影響

根據(jù)擬合模型繪制乳白香青綠原酸的響應(yīng)面圖，可直觀地看出響應(yīng)面的最高點(diǎn)，即參數(shù)范圍內(nèi)的極值以及因素間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，依次可以確定最佳工藝參數(shù)范圍。Design-Expert 8.05軟件處理后三維響應(yīng)面圖見圖6。

通過模型方程所作的響應(yīng)曲面圖，可直觀地描述各因素對(duì)響應(yīng)值（綠原酸含量）的影響和各個(gè)因素間的交互作用。由圖6可以看出，響應(yīng)曲面均是開口向下的凸面，等高線近似為圓形，其中心位于所考察區(qū)域內(nèi)，說明在考察的區(qū)域范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的極大值，同時(shí)響應(yīng)面為突出的曲面，即簡(jiǎn)單的一次線性方程難以解析。

通過Design-Expert 8.05軟件分析各因素對(duì)乳白香青中綠原酸得率的影響得出結(jié)論，甲醇提取乳白香青綠原酸的最佳條件為提取溫度41.33℃、甲醇濃度66.33%和液料比31.33∶1。在此條件下綠原酸提取量可達(dá)5.3295mg/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行乳白香青中綠原酸甲醇提取實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的情況，將乳白香青綠原酸最佳提取條件修正為提取溫度41℃、甲醇濃度66%、液料比31∶1，實(shí)際測(cè)得的綠原酸含量為5.2796mg/g，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的乳白香青中綠原酸甲醇提取工藝參數(shù)基本準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

乳白香青成分復(fù)雜，采用紫外分光光度法測(cè)定[18]時(shí)雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，無法對(duì)其活性成分綠原酸進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[19]采用HPLC法并進(jìn)行優(yōu)化，以乙睛-0.3%磷酸溶液（13∶87）為流動(dòng)相，分離度好、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便、數(shù)據(jù)可靠，可用于乳白香青中綠原酸含量的質(zhì)量控制。

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)乳白香青綠原酸提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，各因素指標(biāo)之間的關(guān)系不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。從本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所繪制的曲面圖可以看出，提取溫度、液料比、甲醇濃度3個(gè)因素對(duì)乳白香青中綠原酸成分提取率的效應(yīng)趨勢(shì)，液料比對(duì)考察指標(biāo)影響較大，提取溫度與提取濃度對(duì)考察指標(biāo)的影響較小。通過回歸方程優(yōu)化得乳白香青中綠原酸的最佳提取工藝為：提取溫度41℃，料液比31∶1，甲醇濃度為66%，此條件下乳白香青中綠原酸平均提取得率為5.2796mg/g，高于優(yōu)化前的提取率3.8356mg/g。響應(yīng)面法優(yōu)化乳白香青中綠原酸提取率比優(yōu)化前提高了27.40%。回歸分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用響應(yīng)面法優(yōu)化乳白香青中綠原酸的提取工藝條件，得到的綠原酸提取工藝流程具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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