李貴節(jié)，陳曉麟，張騰輝

(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程系，重慶 400067)

甲醛(formaldehyde)是世界衛(wèi)生組織確定的致癌和致畸形物質(zhì)，公認(rèn)的變態(tài)反應(yīng)源，也是潛在的強(qiáng)致突變物之一，在我國(guó)有毒化學(xué)品優(yōu)先控制名單上高居第二位。大量文獻(xiàn)記載，甲醛對(duì)人體健康的影響主要表現(xiàn)在嗅覺(jué)異常、刺激、過(guò)敏、肺功能異常、肝功能異常和免疫功能異常等方面。長(zhǎng)期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻咽癌、結(jié)腸癌、腦瘤、月經(jīng)紊亂、細(xì)胞核的基因突變，DNA 單鏈內(nèi)交連和DNA 與蛋白質(zhì)交連及抑制DNA 損傷的修復(fù)、妊娠綜合癥、引起新生兒染色體異常、白血病，引起青少年記憶力和智力下降。

香菇(Lentinula edodes)又名花菇、香蕈、椎耳、冬菰、厚菇，為擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱、傘菌目、口蘑科、香菇屬真菌;菌體似傘型，肉肥厚，色灰白，糯軟鮮香。香菇不但具有清香味鮮的獨(dú)特風(fēng)味，香菇中的香菇多糖還具有一定的調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗突變、抗氧化、降血脂等生理調(diào)節(jié)作用［1-5，22］。然而，一個(gè)不容忽視的問(wèn)題是大量香菇制品含有甲醛甚至甲醛超標(biāo):深圳市疾病預(yù)防控制中心對(duì)香菇中甲醛含量的監(jiān)測(cè)報(bào)告指出，在測(cè)定的20 種干香菇中，甲醛含量在21.3-369.5 mg/ kg 之間，測(cè)定的14 種鮮香菇中甲醛含量為4.0-54.1 mg/kg［6］;對(duì)重慶市場(chǎng)上香菇中甲醛含量的研究發(fā)現(xiàn)，檢查的10 種干香菇甲醛含量均在100-200 mg/ kg內(nèi)，5 種鮮香菇甲醛含量為4-25 mg/ kg，香菇中甲醛檢出率為100%［7］。近年來(lái)，日本、香港及歐盟等媒體紛紛炒作“中國(guó)產(chǎn)香菇中含有甲醛”，這些事件引起輸入國(guó)政府的高度關(guān)注及其商界與消費(fèi)者的疑慮，使我國(guó)香菇產(chǎn)業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品出口業(yè)蒙受了巨大的經(jīng)濟(jì)和信譽(yù)損失。

事實(shí)上，大量研究表明:甲醛主要是香菇在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中逐步形成的，是香菇特有的正常生理代謝產(chǎn)物［8］。林樹(shù)錢(qián)等［9］在對(duì)香菇生長(zhǎng)發(fā)育和加工貯存中甲醛含量變化的初步研究后指出，在香菇不同發(fā)育階段，其菇體內(nèi)甲醛含量不同。李綺等［10］在香菇栽培料中加入霉克星2 號(hào)(一種含甲醛的滅菌劑)，香菇中甲醛含量無(wú)明顯變化。香菇中的甲醛不是人為添加或環(huán)境污染所致，而是香菇生長(zhǎng)代謝、采后保鮮及干燥過(guò)程中自然產(chǎn)生的。

1 香菇中內(nèi)源性甲醛的產(chǎn)生機(jī)制

上世紀(jì)70 年代，Kyoden Yasumoto 等［11］提出香菇中的主要風(fēng)味物質(zhì)香菇精是由其前體物質(zhì)香菇酸在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，GGT)和半胱氨酰亞砜裂解酶(S-alkyl-cysteine sufoxidase，C-S lyase)的作用下形成的。反應(yīng)具體過(guò)程為:γ-谷氨酞轉(zhuǎn)肽酶作用脫去香菇酸上的谷氨酰部分，生成脫谷氨酰香菇酸;接著半胱氨酰亞砜裂解酶作用脫谷氨酰香菇酸產(chǎn)生不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物并同時(shí)轉(zhuǎn)化為香菇精和甲醛等物質(zhì)［8］。即甲醛是香菇風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生過(guò)程中的副產(chǎn)物。采收后，香菇子實(shí)體中甲醛含量仍在繼續(xù)增加，并且干燥加工后的香菇中甲醛含量顯著高于鮮香菇［9，12］;Yada 等也報(bào)道，鮮香菇中甲醛含量為8-24 mg/ kg，而干香菇中達(dá)100-230 mg/ kg，含量較高。Fujimoto 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，采收后的香菇子實(shí)體在香菇酶的作用下，其甲醛含量會(huì)逐漸增加。

2 香菇中內(nèi)源性甲醛的存在形式與毒性研究

現(xiàn)有關(guān)于甲醛毒性的研究大都以游離態(tài)甲醛為對(duì)象進(jìn)行研究，相應(yīng)的對(duì)其毒性評(píng)價(jià)也按照游離態(tài)的甲醛處理，認(rèn)為它們具有三致作用;而對(duì)于內(nèi)源性甲醛以何種狀態(tài)存在于香菇中、其存留形式是否對(duì)其毒性產(chǎn)生影響等問(wèn)題，還鮮有報(bào)道。張燁［14］對(duì)不同香菇樣品采用直接水蒸餾法提取游離態(tài)甲醛，加酸水蒸餾法提取總甲醛，分別以乙酞丙酮法測(cè)定含量，發(fā)現(xiàn)香菇中甲醛以游離和結(jié)合兩種狀態(tài)存在，其中游離態(tài)甲醛與結(jié)合態(tài)甲醛之比為34.1%～39.5%。進(jìn)一步研究表明，香菇中的蛋白質(zhì)和香菇多糖能夠結(jié)合甲醛，結(jié)合量分別為71.6 mg/ kg 和229.9 mg/ kg。用香菇水提液和等同于其總甲醛含量的甲醛溶液進(jìn)行蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)和Ames 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)香菇水提取液對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的產(chǎn)生有顯著的抑制作用，抑制率隨香菇水提取液濃度的升高而增強(qiáng);而等當(dāng)量甲醛溶液濃度大于140.4 mg/ L 后，蠶豆根尖微核率顯著上升。2)Ames 實(shí)驗(yàn)中，香菇水提取液所誘發(fā)的測(cè)試菌株TA97、TA98 的回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2 倍，檢測(cè)結(jié)果為陰性;等當(dāng)量甲醛溶液所誘發(fā)的測(cè)試菌株TA97 的回變菌落數(shù)未超過(guò)自發(fā)回變數(shù)的2 倍，而誘發(fā)的測(cè)試菌株TA98 的回變菌落數(shù)超過(guò)了自發(fā)回變數(shù)的2 倍以上。該研究初步表明，實(shí)驗(yàn)濃度下的香菇水提取液沒(méi)有表現(xiàn)出遺傳毒性，而等量甲醛溶液則呈現(xiàn)遺傳毒性。這一結(jié)果提示，對(duì)香菇中甲醛的存在形式及毒性等應(yīng)進(jìn)行深入研究，不能直接根據(jù)樣品處理后游離甲醛的毒性結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)香菇內(nèi)源性甲醛的毒性。

3 香菇內(nèi)甲醛的檢測(cè)方法

已報(bào)道的甲醛測(cè)定方法主要有色譜法、吸光光度法、極譜法、動(dòng)力學(xué)分析法、流動(dòng)注射法等，這些方法適用于大氣中、水中甲醛含量的測(cè)定。我國(guó)現(xiàn)有的食品衛(wèi)生理化檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)食品包裝材料、容器涂料釋放或溶出的甲醛限量做出規(guī)定，包括香菇在內(nèi)的食品尚無(wú)甲醛檢測(cè)項(xiàng)目。

目前香菇甲醛的測(cè)定 多采用乙酰丙酮法。陳乃平［15］用乙酰丙酮分光光度法測(cè)定微量甲醛時(shí)證明，此法具有線性關(guān)系好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。加標(biāo)范圍在93.2%～100%、置信度95%，其準(zhǔn)確度完全能滿足控制分析的要求。乙酰丙酮分光光度法測(cè)定甲醛的原理為:在過(guò)量按鹽存在下，甲醛與乙酰丙酮生成黃色化合物，于最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行光度測(cè)定，甲醛含量在0～4 μg/ ml 范圍內(nèi)符合比耳定律。

HPLC 法通常是基于2，4－二硝基苯肼(DNPH)與甲醛發(fā)生衍生反應(yīng)，生成2，4－二硝基苯肼－甲醛腙(HCHO 一DNPHo)后用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。彭錦峰等在考慮了衍生化的酸度，衍生試劑的濃度，溫度，時(shí)間等影響因素的基礎(chǔ)上，確立了最佳測(cè)定條件，建立了用高效液相色譜測(cè)定香菇中甲醛的方法:將食用香菇用水提取，提取液經(jīng)2，4－二硝基苯肼衍生后，測(cè)定其中的甲醛。外標(biāo)法定量測(cè)定時(shí)，甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與樣品質(zhì)量濃度在10.7-856 μg/ L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，方法的檢出限為8.2 μg/ L［16］。

甲醛檢測(cè)儀是一種利用傳感器工作原理檢測(cè)氣體中甲醛蒸汽含量的精密儀器，采樣時(shí)用泵吸入樣品氣體進(jìn)入傳感器后轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，信號(hào)與甲醛蒸汽濃度成正比，由顯示器顯示樣品實(shí)際濃度值。該法對(duì)低濃度甲醛的測(cè)定靈敏度較高，準(zhǔn)確度可達(dá)±0.02×10－6。香菇在密閉容器中密封直至容器內(nèi)甲醛含量達(dá)到平衡，采用甲醛檢測(cè)儀測(cè)定，實(shí)驗(yàn)表明顯示數(shù)值隨蒸汽濃度變化，兩者呈現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)性［17］。

4 香菇產(chǎn)生內(nèi)源性甲醛的影響因素與調(diào)控方法

4.1 影響香菇內(nèi)源性甲醛含量的因素

4.1.1 生產(chǎn)用培養(yǎng)基的成分影響內(nèi)源性甲醛含量:柯樂(lè)芹［18］對(duì)白楊木屑、雜木屑、楓樹(shù)木屑和櫟樹(shù)木屑培養(yǎng)基中本底甲醛含量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各樹(shù)種木屑中均含有微量甲醛，分別為24.91、17.31、14.22、12.13 mg/ kg，且混合培養(yǎng)基甲醛含量比純木屑明顯升高。福建農(nóng)林大學(xué)在比較菌草香菇與木屑香菇品質(zhì)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):菌草香菇所含的甲醛量是木屑香菇的1.96 倍，說(shuō)明培養(yǎng)基成分的改變使香菇中的甲醛含量發(fā)生了變化［19］。

4.1.2 出菇管理模式影響對(duì)內(nèi)源性甲醛含量:研究發(fā)現(xiàn)覆土式、層架式和大棚式三種栽培模式下子實(shí)體甲醛含量順次降低［18］。因覆土栽培菌棒中甲醛不易散發(fā)，故含量高;層架式栽培在單位面積內(nèi)菌棒密度大，可能造成了較高的甲醛水平;而大棚栽培因通風(fēng)條件好，所以相對(duì)甲醛含量最低。

4.1.3 貯存時(shí)間長(zhǎng)短影響干菇和鮮菇甲醛含量:干菇貯存一年后甲醛含量比鮮菇剛烘干后甲醛含量低2.7倍。將干菇浸泡，吸透水分1h，煮熟5 min，香菇中甲醛含量明顯降低，湯液中含有微量甲醛。鮮菇采收當(dāng)日即烘干比低溫貯存后烘干的干香菇中甲醛含量高［9］。經(jīng)沸水處理后香菇中甲醛含量明顯降低［10］。

4.2 香菇內(nèi)源性甲醛的調(diào)控方法

4.2.1 控制甲醛生成的代謝途經(jīng):刁恩杰［7］研究發(fā)現(xiàn)，在香菇培養(yǎng)基中添加II 型益菇粉，收獲的鮮香菇中甲醛含量為5.8 mg/ kg，干香菇中甲醛為30 mg/ kg，與對(duì)照組相比減少4/5。該研究還發(fā)現(xiàn)Cu2+、Pb2+、Zn2+可以抑制香菇酶的活性，從而控制甲醛的含量。胡子豪［12］研究了與谷胱甘肽代謝途徑相關(guān)的物質(zhì)對(duì)香菇甲醛代謝的影響，發(fā)現(xiàn)添加谷胱甘肽、半胱氨酸和谷氨酸的混合物以及硫酸鈉可使甲醛含量顯著變化;生物信號(hào)分子NO 及抗壞血酸類抗氧化物也能降低香菇內(nèi)源性甲醛的含量。夏苗等人［20］研究了氣調(diào)包裝(MAP)對(duì)貯藏期間香菇甲醛含量的作用，發(fā)現(xiàn)香菇甲醛含量與GGT 和C-S lyase 比酶活呈顯著正相關(guān)，而兩種酶活又與香菇的呼吸強(qiáng)度呈顯著正相關(guān);因此采用CO2MAP 抑制其酶活，從而能控制香菇甲醛的含量。

4.2.2 增強(qiáng)甲醛分解的代謝途經(jīng):該作用主要涉及甲醛氧化、無(wú)糖磷酸代謝、氨基酸代謝等通路。其中甲醛氧化途經(jīng)主要涉及到甲醛脫氫酶(FDH)、硫代甲?；入赘孰乃饷?FGH)、谷胱甘肽甲醛活化酶(Gfa)等。激活這些氧化分解甲醛的關(guān)鍵酶，促進(jìn)香菇自身代謝部分清除內(nèi)源性甲醛，從而可維持甲醛處于無(wú)毒害的較低水平。

4.2.3 利用物理、化學(xué)處理除去甲醛:甲醛易揮發(fā)、易溶于水。林樹(shù)錢(qián)等人［9］將干香菇浸泡于水中1h后，煮沸5min，菇體內(nèi)甲醛含量顯著降低。張燁［14］通過(guò)浸泡、燉煮和油炸處理香菇，發(fā)現(xiàn)鮮香菇浸泡30min 后甲醛含量由7.70 mg/ kg 降至4.13 mg/kg，燉煮25min 后甲醛含量從3.71 mg/ kg 降至1.70 mg/ kg，油炸4min 后甲醛含量由11.82 mg/ kg減少到5.25 mg/ kg。甲醛在香菇蒸煮過(guò)程中能與半胱氨酸結(jié)合生成四氫噻唑-4-羧酸，該反應(yīng)不僅降低甲醛含量，其產(chǎn)物還能與人體內(nèi)亞硝酸鹽結(jié)合，預(yù)防癌癥發(fā)生［21］。刁恩杰［7］將香菇浸泡于50 mg/ L半胱氨酸溶液中30min，處理樣品甲醛含量比對(duì)照組降低28.90-65.14%。

5 問(wèn)題與展望

香菇內(nèi)源性甲醛是食品安全中的一個(gè)重要問(wèn)題。雖然國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)取得一定的成果，但對(duì)于甲醛產(chǎn)生途徑及機(jī)制的研究尚淺，對(duì)于香菇中甲醛結(jié)合物質(zhì)的種類和結(jié)合方式還不夠了解，結(jié)合態(tài)甲醛的毒性指數(shù)及安全性還缺乏一套行之有效的評(píng)價(jià)體系。此外，對(duì)內(nèi)源性甲醛的調(diào)控技術(shù)和快速檢測(cè)手段也研究較少。未來(lái)將更多從分子生物學(xué)水平上研究甲醛產(chǎn)生相關(guān)酶系及其機(jī)理，通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)等方法篩查香菇體內(nèi)甲醛代謝酶類的基因，分析甲醛代謝相關(guān)酶啟動(dòng)子序列及上游調(diào)控元件，從而了解基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步研究香菇中甲醛與組織內(nèi)的小分子及蛋白、多糖等大分子的結(jié)合方式，探究其對(duì)甲醛毒理學(xué)的改變效應(yīng)。尋找和研發(fā)高效安全的香菇甲醛分析檢測(cè)和調(diào)控技術(shù)，從而最終提高香菇這一傳統(tǒng)美味和功能性食品的安全性。

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