趙 佩，牛爭平，劉平平，雷小峰，楊清和

偏頭痛是一種常見的慢性神經(jīng)血管性頭痛，患病率約為15%［1］。世界衛(wèi)生組織將嚴重偏頭痛定性為最致殘的慢性疾病之一，其發(fā)作類同于癡呆、四肢癱瘓和嚴重精神?。?］。本研究觀察養(yǎng)血清腦顆粒對硝酸甘油致偏頭痛大鼠硬腦膜肥大細胞脫顆粒的影響，探討偏頭痛的發(fā)病機制及養(yǎng)血清腦顆粒防治偏頭痛的作用環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 健康雄性清潔級Wistar大鼠108只，體重250 g～300 g，均由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，安靜屏障環(huán)境喂養(yǎng)。硝酸甘油注射液：造模藥物，由北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批準文號：國藥準字 H11020289，產(chǎn)品批號：20120601）。養(yǎng)血清腦顆粒天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)（批準文號：國藥準字Z10960082，產(chǎn)品批號：120208），每袋4 g，用蒸餾水配制成高劑量養(yǎng)血清腦顆粒溶液（0.32 g／m L）及低劑量養(yǎng)血清腦顆粒溶液（0.16 g／mL）備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模與分組 將108只健康雄性Wistar大鼠分為正常對照組、模型對照組、治療高劑量組、治療低劑量組、預防高劑量組及預防低劑量組，各組再隨機分為30 min、60 min、180 min組，分別于造模后相應時間點處死大鼠切取標本。根據(jù)Tassorelli［3］皮下注射硝酸甘油建立大鼠偏頭痛模型。正常對照組予皮下注射生理鹽水，大鼠出現(xiàn)短時間的、次數(shù)不多的撓頭、爬籠動作，未見耳紅。治療高、低劑量組大鼠在造模后10 min分別灌胃高、低劑量養(yǎng)血清腦顆粒1次，預防高、低劑量組大鼠在造模前分別灌胃高、低劑量養(yǎng)血清腦顆粒7 d。

1.2.2 標本制備 正常對照組、模型對照組、治療高劑量組、治療低劑量組、預防高劑量組及預防低劑量組的30 min、60 min、180 min亞組于造模后灌注固定。于撓頭明顯側(cè)剪取2塊硬腦膜組織，將其投入4%多聚甲醛（p H 7.4，4℃）過夜固定，第二天行石蠟包埋切片，每張4μm，連續(xù)切片5張。根據(jù)趙汝香等［4］所述的Brandon改良甲苯胺藍染色法對肥大細胞進行特染。計數(shù)肥大細胞（MCs）總數(shù)和脫顆粒數(shù)目（胞膜出現(xiàn)明顯破裂或有顆粒外逸為脫顆粒）。計算肥大細胞脫顆粒陽性率。

1.3 統(tǒng)計學處理 計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。各組間先行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗。在各組總體方差相等的情況下，采用單因素的方差分析，各組間比較用LSD-t比較。分析給藥順序、劑量、時間的交互效應采用析因設計方差分析。檢驗水準為α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 行為學觀察 通過對大鼠各時段爬籠、撓頭、咬趾、往返等行為學指標進行觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組在造模后30 min內(nèi)偏頭痛相關(guān)行為明顯多于其他時間段，考慮為給藥操作激惹所致。治療高、低劑量組各時段與模型對照組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），預防高、低劑量組與模型對照組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.2 硬腦膜肥大細胞脫顆粒陽性率 鏡下可見肥大細胞多分布于血管周圍，呈圓形或橢圓形，胞漿內(nèi)充滿嗜堿性顆粒，被甲苯胺藍染成藍紫色或紫紅色，其中部分肥大細胞膜破裂，可見紫紅色顆粒逸出細胞外，甚至喪失原有的細胞形態(tài)，僅見呈爆裂樣成簇分布的紫紅色顆粒。詳見表1。

表1 治療組與對照組大鼠不同時點MC脫顆粒陽性率（±s） %

表1 治療組與對照組大鼠不同時點MC脫顆粒陽性率（±s） %

組別 n 30 min 60 min 180 min正常對照組6 10.60±6.46 9.95±3.85 11.38±4.00模型對照組 6 45.53±4.54 56.70±3.60 64.49±3.44治療高劑量組 6 45.46±4.76 58.23±3.88 67.69±4.99治療低劑量組 6 47.05±6.19 59.53±3.55 66.44±3.19 F值 61.145 252.131 287.659 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001注：組間多重比較LSD-t在α＝0.05，P＜0.05。

表2 預防組與對照組大鼠不同時點MC脫顆粒陽性率±s） %

表2 預防組與對照組大鼠不同時點MC脫顆粒陽性率±s） %

組別 n 30 min 60 min 180 min正常對照組6 10.60±6.46 9.95±3.85 11.38±4.00模型對照組 6 45.53±4.54 56.70±3.60 64.49±3.44預防高劑量組 6 24.92±4.95 30.66±4.80 53.94±2.30預防低劑量組 6 26.50±6.59 33.13±5.34 52.62±4.75 F值 37.876 110.676 236.988 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001注：組間多重比較L SD-t在α＝0.05，P＜0.05。

表3 大鼠MC脫顆粒陽性率2×2×3析因試驗方差分析表

3 討 論

1983年有學者發(fā)現(xiàn)［5］，肥大細胞可能參與偏頭痛的發(fā)病過程，流行病學研究顯示患有MC相關(guān)疾?。ㄈ缦裾?、鼻炎及間質(zhì)性膀胱炎）的患者中偏頭痛發(fā)病率明顯增高，MC與偏頭痛密切聯(lián)系［6］，硬腦膜或大腦的肥大細胞可能參與發(fā)作過程。肥大細胞起源于遠處骨髓中的祖先細胞，通過軟腦膜進入腦組織并在局部微環(huán)境中成熟［7］，通常位于血管周圍，與神經(jīng)元關(guān)系密切。肥大細胞不僅在免疫反應中至關(guān)重要，而且也參與炎癥反應［8］、自身免疫反應［9，10］等，尤其在那些與情緒有關(guān)的疾病中發(fā)揮重要作用［11］。當三叉神經(jīng)［12］、頸部［13］或 者蝶顎部 神 經(jīng)節(jié)［14］受到刺激后會激活硬腦膜上的肥大細胞。動物實驗表明神經(jīng)肽類 物 質(zhì) ，如P物 質(zhì) （SP）［15］、垂 體 腺 苷 酸 環(huán) 化 酶 激 活 肽（PACAP）［16］、CGRP［15，17］、生 長 抑 素［18］、神 經(jīng) 加 壓 素（NT）［19］、甲狀旁腺激素［20］等，均可刺激肥大細胞脫顆粒并分泌炎癥介質(zhì)。腦膜痛覺感受器激活后這些神經(jīng)肽類可能由神經(jīng)周圍突分泌［21］。其他研究顯示［22］，精神壓力作為偏頭痛的誘發(fā)因素，通過由促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）介導的相關(guān)機制也可誘導硬腦膜肥大細胞脫顆粒。肥大細胞脫顆粒可以分泌多種與偏頭痛密切相關(guān)的介質(zhì)，如組胺、白三烯［23］、腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-6［24］、內(nèi)皮素-1［25］等。肥大細胞還分泌各種促炎介質(zhì)，比如激肽、前列腺素。大腦肥大細胞可以調(diào)節(jié)腦內(nèi)血管的滲透性［26］。

伴有先兆的偏頭痛發(fā)作時，皮層擴散抑制（CSD）致腦膜痛覺感受器激活，很可能通過神經(jīng)軸突反射促使硬腦膜肥大細胞脫顆粒。而肥大細胞脫顆?？梢赃M一步使腦膜痛覺感受器及偏頭痛痛覺通路維持激活狀態(tài)。肥大細胞分泌的多種因子中作為偏頭痛介質(zhì)激活腦膜痛覺感受器的可能有5-羥色胺（5-HT）、前列環(huán)素，另外還可能有組胺、類胰蛋白酶［27、28］，其中5-HT作用最為重要。5-HT主要通過其中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用參與偏頭痛的發(fā)病，但是其對腦膜痛覺感受器強大的調(diào)節(jié)作用提示很可能存在5-HT致偏頭痛的周圍機制［29］。

本實驗根據(jù)Brandon等改良后的甲苯胺藍染色法對硬腦膜肥大細胞進行研究，結(jié)果顯示模型對照組大鼠硬腦膜肥大細胞脫顆粒陽性率明顯高于其他各組，硝酸甘油致偏頭痛模型可以增加硬腦膜肥大細胞脫顆粒陽性率，說明了NO具有誘導肥大細胞脫顆粒的作用，印證了偏頭痛發(fā)病過程中存在肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象，且主要位于硬腦膜上，它可能參與了NO所致的三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活過程。為了減少實驗誤差和避免精神壓力對實驗大鼠的影響，我們選擇了安靜屏障環(huán)境喂養(yǎng)大鼠及進行各階段實驗，單獨環(huán)境進行單鼠實驗操作，以減少對大鼠的各種刺激。

本實驗觀察高、低劑量養(yǎng)血清腦顆粒對硝酸甘油致偏頭痛大鼠模型的治療和預防作用，發(fā)現(xiàn)造模后30 min內(nèi)預防高、低劑量組偏頭痛大鼠硬腦膜肥大細胞脫顆粒陽性率與模型對照組相比即有明顯降低，而預防高劑量組與預防低劑量組相比未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，提示預防性使用養(yǎng)血清腦顆粒可能在偏頭痛起始階段發(fā)揮抗偏頭痛作用，該作用可能與其在發(fā)作早期穩(wěn)定肥大細胞膜減少脫顆粒有關(guān)，也說明其對偏頭痛的預防作用可能大于治療作用，與臨床試驗結(jié)果相一致［30］。針對各因素交互效應的方差分析結(jié)果顯示，給藥順序（即治療性干預或者預防性干預）對行為學指標及硬腦膜肥大細胞脫顆粒陽性率的影響較為明顯，而給藥劑量以及兩者的交互作用不顯著，目前還不能認為預防性使用高劑量的養(yǎng)血清腦顆粒能夠產(chǎn)生更大的療效，仍需擴大樣本量延長試驗周期進一步研究論證。

［1］ Lipton RB，Bigal ME.Migraine：Epidemiology，impact，and risk factors for progression［J］.Headache，2005，45（Suppl1）：s3-s13.

［2］ Goadsby PJ，Lipton RB，F(xiàn)errari FB.Migraine-current understanding and treatment［J］.N Engl J Med，2002，346（4）：257-270.

［3］ Tassorelli C，Nappi G，Joseph SA.Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in rat brain ［J］.Brain Research，1995，682（1-2）：167-181.

［4］ 趙香汝，王家鑫，崔平.肥大細胞用甲苯胺藍染色之體會［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2000，9（3）：359.

［5］ Sicuteri F.Mast cell and their active substances：Their role in the pathogenesis of migraine［J］.Headache，1963，3（3）：86-92.

［6］ Low NC，Merikangas KR.The comorbidity of migraine［J］.CNS Spectrum，2003，8（06）：433-434；437-444.

［7］ Wedemeyer J，Tsai M，Galli SJ.Roles of mast cells and basophils in innate and acquired immunity［J］.Current Opinion Immunology，2000，12（6）：624-631.

［8］ Theoharides TC.The mast cell：A neuroimmunoendocrine master player［J］.Int J Tissus React，1996，18（1）：1-21.

［9］ Benoist C，Mathis D.Mast cells in autoimmune disease［J］.Nature，2002，420 （6917）：875-878.

［10］ Puxeddu I，Piliponsky AM，Bachelet I.Mast cells in allergy and beyond［J］.Biochem Cell Biol，2003，35（12）：1601-1607.

［11］ Theoharides TC，Cochrane DE.Critical role of mast cells in inflammatory diseases and the effect of acute stress［J］.J Neuroimmunology，2004，146（1-2）：1-12.

［12］ Dimitriadou V，Buzzi MG，Theoharides TC.Ultrastructural evidence for neurogenically mediated changes in blood vessels of the rat dura mater and tongue following antidromic trigeminal stimulation［J］.Neuroscience，1992，48（1）：187-203.

［13］ Keller JT，Dimlich RV，Zuccarello M.Influence of the sympathetic nervous system as well astrigeminal sensory fibres on rat dural mast cells［J］.Cephalalgia，1991，11（5）：215-222.

［14］ Delepine L，Aubineau P.Plasma protein extravasation induced in the rat dura mater by stimulation of the parasympathetic sphenopalatine ganglion［J］.Experimental neurology，1997，147（2）：389-400.

［15］ Ottosson A.Edvinsson L.Release of histamine from dural mast cells by substance P and calcium gene-related peptide［J］.Cephalalgia，1997，17（3）：166-174.

［16］ Seebeck J，Kruse ML，Schmidt-Choudhury A，et al.Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide induces degranulation of ratperitoneal mast cells via high-affinity PACAP receptor-independent activation of G proteins［J］.1998，865（11）：141-146.

［17］ Schwenger N，Dux M，de Col R，et al.Interaction of calcitonin gene-related peptide，nitric oxide and histamine release in neurogenic blood flow and afferent activation in the rat cranial dura mater［J］.Cephalalgia，2007，27（6）：481-491.

［18］ Theoharides TC，Douglas WW.Somatostatin induces histamine secretion from rat peritoneal mast cells［J］.Endocrinology，1978，102（5）：1637-1640.

［19］ Carraway R，Cochrane DE，Lansman JB.Neurotensin stimulates exocytotic histamine secretion from rat mast cells and elevates plasma histamine levels［J］.Physiology，1982，323：403-414.

［20］ Tsakalos ND，Theoharides TC，Kops SK.Induction of mast cell secretion by parathormone［J］.Biochemical pharmacology，1983，32（2）：355-360.

［21］ Waeber C，Moskowitz MA.Migraine as an inflamatory disorder［J］.Neurology，2005，64（Suppl2）：s9-s15.

［22］ Theoharides TC，Spanos C，Pang X，et al.Stress-induced intracranial mast cell degranulation：A corticotropinreleasing hormone-mediated effect［J］.Endocrinology，1995，136（12）：5745-5750.

［23］ Sheftell F，Rapoport A，Weeks R，et al.Montelukast in the prophylaxis of migraine：A potential role for leukotriene modifiers［J］.Headache，2000，40（2）：158-163.

［24］ Sarchielli P，Alberti A，Baldi A，et al.Proinflamatory cytokines，adhesion molecules，and lymphocyte integrin expression in the internal jugular blood of migraine patients without aura assessed ictally［J］.Headache，2006，46（2）：200-207.

［25］ Hasselblatt M，Kohler J，Volles E.Simultaneous monitoring of endothelin-1 and vasopressin plasma levels in migraine［J］.Neuroreport，1999，10（2）：423-425.

［26］ Zhuang X，Silverman AJ，Silver R.Brain mast cell degranulation regulates blood–brain barrier［J］.Neurobiology，1996，31（4）：393-403.

［27］ Zhang X，Strassman AM，Burstein R.Sensitization and activation of intracranial meningeal nociceptors by mast cell mediators［J］.J Pharmacol Exp Ther，2007，322（2）：806-812.

［28］ Zhang XC，Levy D.Modulation of meningeal nociceptors mechanosensitivity by peripheral proteinase-activated receptor-2：The role of mast cells［J］.Cephalalgia，2008，28（3）：276-284.

［29］ Dan L，Migraine P.Meningeal Inflammation，and mast cells［J］.Curr Pain Headache Rep，2009，13（3）：237-240.

［30］ 陳凌，呂磊，胡萬華，等.養(yǎng)血清腦顆粒預防偏頭痛發(fā)作的臨床觀察［J］.浙江中醫(yī)雜志，2009，44（3）：184-185.