鐘大妮等

【摘要】 目的：研究廣西地區(qū)乙肝病毒基因型分布及與臨床表現(xiàn)及機(jī)體免疫功能的關(guān)系。方法：收集廣西地區(qū)原籍人口不同病情的慢性乙肝病毒相關(guān)性疾病包括無癥狀攜帶者（ASC）、慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、乙肝后肝硬化（LC）、原發(fā)性肝癌（HCC）血液標(biāo)本，檢測乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc和抗-HBcIgM），HBVDNA拷貝數(shù)，肝功能，T淋巴細(xì)胞亞群，型特異性引物巢式PCR及測序鑒定病毒基因型，利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行資料分析。結(jié)果：本研究檢測納入的研究對(duì)象感染乙肝病毒為B、C兩種基因型，未檢測到其他基因型，以C型（66.3%）為主，B型（33.7%）次之。C基因型的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率低于B型（P<0.05）。C型在肝癌組的比例顯著高于其他疾病組（P<0.05），不同基因型間年齡、HBVDNA拷貝數(shù)、AST、ALT、T細(xì)胞亞群CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：廣西地區(qū)乙肝病毒感染相關(guān)性肝病患者HBV基因型為B型、C型，以C型為主，C型與較嚴(yán)重病情有關(guān)，感染不同HBV基因型與機(jī)體的免疫狀況無明顯相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 乙肝病毒； 基因型； 臨床表現(xiàn)； T淋巴細(xì)胞亞群

乙型病毒性肝炎是危害嚴(yán)重的慢性傳染性疾病，迄今全世界至少有3.5億人感染乙肝病毒（HBV）[1]。廣西是乙肝病毒的高流行區(qū)，人群中乙肝病毒的攜帶率基數(shù)大，乙型肝炎發(fā)病率約為60.5/10萬[2]。慢性HBV感染致肝細(xì)胞炎癥損傷，遷延反復(fù)，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死及纖維結(jié)締組織增生，發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重威脅人類生命健康[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒可根據(jù)全基因序列差異>8%或S基因片段差異>4%分為A-H共8個(gè)基因型，在我國主要是B型和C型[4]；HBV傳播方式、臨床表現(xiàn)、疾病轉(zhuǎn)歸、抗病毒治療效果與病毒的基因分型都有一定的相關(guān)性[5]。為了解廣西地區(qū)乙肝病毒基因分型和致病性差異，病毒基因型和不同嚴(yán)重程度慢乙肝機(jī)體免疫功能的差異的關(guān)系，本研究收集了廣西原籍人口無癥狀乙肝病毒攜帶者（ASC），輕、中、重慢乙肝患者（CHB），乙肝肝硬化（LC）以及肝癌（HCC）患者血清標(biāo)本，進(jìn)行不同疾病譜的HBV基因型分析及比較感染不同基因型的機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群情況。

1 材料與方法

1.1 材料 乙肝病毒標(biāo)記物試劑盒（艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（Eppenndorf Centeifuge，德國）；PCR擴(kuò)增儀（PTC-220MJ Reaearch， USA）；DYY-2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；紫外分析儀（UV-1700（E）230CE，日本島津公司）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國Becton-Kickin-son公司）；血清病毒DNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；PCR Mix緩沖液及超純水（大連寶生物有限公司）；東勝M(fèi)arker（上海東勝生物公司）；瓊脂糖（日本TaKaRa公司）；FACSCount Reagent Kit（美國BD公司）引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道，分別為兩條外引物P1、P1R；公用上游引物P2，A、B、C三型特異下游引物；公用下游引物P3R，D、E、F三型特異上游引物，共10條引物，由生工生物（上海）有限公司生產(chǎn)。血液樣本來源于2008-2011年廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院傳染科門診及住院部、肝膽外科住院部，廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院住院部患者，診斷符合2005年修訂《慢性乙型肝炎防治指南》[7]，入選患者排除甲肝、丙肝、戊肝、HIV、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病。

1.2 方法

1.2.1 HBV marker（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）檢測 嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒操作。對(duì)乙肝病毒表面抗原（HBsAg）陽性者，送廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院做熒光定量PCR檢測HBVDNA拷貝數(shù)。

1.2.2 血清病毒基因型檢測 血清病毒DNA提取按照試劑盒說明書。取2 μl乙肝病毒DNA提取液，巢式PCR方法參照文獻(xiàn)，條件稍作改動(dòng)[6]。在0.5 ml離心管中加入上下游外引物（50 pmol/L）各1 μl，25 μl PCR Mix，2 μl病毒DNA提取液，加21 μl超純水至50 μl，輕微震蕩混勻后，進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。取2 μl每一個(gè)樣本的第一輪PCR產(chǎn)物加上A、B、C引物和對(duì)應(yīng)的公用引物（50 pmol/L）各1 μl，PCR Mix、超純水按照第一輪加入。在另一離心管D、E、F基因型的檢測同前所述。將兩組巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，參照Marker得到產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量判斷基因型，A型為68 bp，B型為281 bp，C型為122 bp，D型為119 bp，E型為167 bp，F(xiàn)型為97 bp。對(duì)不能用巢式PCR成功分型的樣本送生工生物工程（上海）有限公司測序。并隨機(jī)選擇10個(gè)成功分型的樣本測序以鑒別本實(shí)驗(yàn)分型的可靠性。

1.2.3 T淋巴細(xì)胞亞群檢測 對(duì)慢乙肝組患者進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8：每個(gè)12×75 mm樣品測定管加入50 μl抗凝血（EDTA-K2抗凝），各管加入10 μl三色單抗，輕微振蕩混勻，室溫避光放置20 min；加1 ml溶血素裂解紅細(xì)胞，輕微振蕩，避光10 min，接著離心棄上清2次，加PBS后上機(jī)檢測。取50 μl全血加10 μl IgG1-FITC/IgG1-PE/IgGl-PE-Cy5（小鼠），作為陰性對(duì)照，其他步驟同上。每份標(biāo)本測定5000個(gè)細(xì)胞，全部數(shù)據(jù)用流式細(xì)胞儀和軟件SYSTEM II獲取和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 HBVDNA先進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)或F分析，率的比較采用 字2檢驗(yàn)，雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究病例納入情況 共收集病例ASC46例，CHB103例，LC58例，HCC46，所有病例乙肝表面抗原（HBsAg）均為陽性，排除病毒DNA拷貝數(shù)<1×103后，得到最后研究病例ASC 31例，CHB 85例（輕度17例，中度36例，重度32例），LC 30例，HCC 35例。男性144例，女性37例，年齡13～84歲。每個(gè)病例組的平均年齡、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乙肝病毒DNA拷貝數(shù)及乙肝病毒e抗原（HBeAg）的情況見表1。

2.2 HBV基因分型 將PCR產(chǎn)物在1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳，基因分型為B型或C型，未檢測到B、C混合型，未發(fā)現(xiàn)其他基因型。將測序結(jié)果與NCBIGene數(shù)據(jù)庫病毒序列比對(duì)得到測序的基因分型為B型或C型。所有病例中B型61例（33.7%），C型120例（66.3%），發(fā)病者主要集中在大于30歲的人群，C基因型的>30歲患者比重較大。各疾病譜基因分型及對(duì)應(yīng)的指標(biāo)值見表2。

2.3 各疾病譜基因型分布 HCC組 C型的比例（91.4%）均高于ASC（67.7%）、CHB（56.5%）、LC（63.3%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ASC組、CHB組、LC組組內(nèi)的C型比例較B型高，但組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 乙肝病毒e抗原與基因型 B型組HBeAg（+）為36.1%，低于C型組的HBeAg（+）的60%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。

2.5 乙肝病毒基因型與病毒DNA拷貝數(shù) B型HBVDNA平均拷貝數(shù)為2.21×107，C型的為1.31×107，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.333）。

2.6 乙肝病毒基因型與ALT、AST的關(guān)系 B基因型組與C基因型組ALT、AST差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PALT=0.486，PAST=0.673）。ASC、CHB、LC、HCC組內(nèi)比較也發(fā)現(xiàn)ALT、AST與基因型無關(guān)。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國流行的HBV基因型主要為B型和C型，但各地區(qū)基因型分布情況不盡相同。本研究發(fā)現(xiàn)，廣西地區(qū)原籍人口中感染的HBV基因型主要為C型，其次為B型。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，北京、黑龍江及廣東、河南、山西等多地區(qū)的主要流行基因型也是C型[8-11]，提示我國的主導(dǎo)基因型為C型，廣西HBV基因型分布與全國一致。

本研究結(jié)果表明，廣西地區(qū)原籍人口C基因型的乙肝病毒相關(guān)性肝病的發(fā)病主要是在25歲之后，這與Yin等[12]先前在國內(nèi)做的社區(qū)調(diào)查的報(bào)道相似。廣西是HCC高發(fā)區(qū)之一，本研究顯示，HCC組C基因型的比例均明顯高于ASC、CHB、LC組，表明C基因型與肝癌的進(jìn)展密切相關(guān)[13]。對(duì)30歲以上的乙肝病毒攜帶者檢測病毒基因分型有助于預(yù)測肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[14]。有研究報(bào)道，C基因型引起的肝臟疾病臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度較B型高，包括較高的肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率、延遲的血清轉(zhuǎn)換、較高的DNA拷貝數(shù)、較高的ALT水平[14-15]；也有研究報(bào)道B基因型引起的臨床表現(xiàn)較為嚴(yán)重[12，16]；Zeng等[17]報(bào)道B、C基因型的肝病嚴(yán)重程度包括肝功能、肝臟炎癥、纖維化差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中廣西地區(qū)原籍人口C型HBeAg血清轉(zhuǎn)換率顯著低于B型的，提示HBV C基因型感染患者病毒的復(fù)制與感染性較B基因型高，但兩種HBV基因型的ALT、AST及HBVDNA水平無顯性差別。報(bào)道的不一致可能與地區(qū)分布的乙肝病毒流行特點(diǎn)、病毒亞型及患者的環(huán)境因素、生活習(xí)慣有關(guān)[18]。

一般認(rèn)為，HBV致肝臟損害主要由機(jī)體對(duì)HBV免疫應(yīng)答介導(dǎo)，肝細(xì)胞感染HBV后在細(xì)胞表面表達(dá)的病毒可引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，多種因素可影響這種免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，其中包括病毒遺傳物質(zhì)多態(tài)性[19-20]。為了解HBV基因型是否與機(jī)體T細(xì)胞免疫有關(guān)，本研究比較了慢性HBV感染相關(guān)性肝病患者B、C基因型外周血的T細(xì)胞亞群CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）的數(shù)量，結(jié)果表明，C基因型的CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）T細(xì)胞與B型均無顯著性差別，此結(jié)果可能與研究樣本相對(duì)較小有關(guān)。綜上所述，廣西地區(qū)流行的HBV以B型、和C型為主，未見其他基因型，或B、C重疊情況。C基因型與較嚴(yán)重的HBV感染相關(guān)性肝病病情有關(guān)，HBV基因型與機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的關(guān)系仍需進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Lavanchy D.Hepatitis B virus epidemiology，disease burden，treatment， and current and emerging prevention and control measures[J].J Viral Hepat，2004，11（2）：97-107.

[2] 沈立萍，楊進(jìn)業(yè)，莫兆軍，等.廣西壯族自治區(qū)1996-2005年乙型肝炎發(fā)病狀況監(jiān)測分析[J].疾病控制雜志，2007，10（2）：210-211.

[3] Weber A，Boege Y，Reisinger F，et al.Chronic liver inflammation and hepatocellular carcinoma： persistence matters[J].Swiss Med Wkly，2011，141（4）：13197.

[4] Schaefer S.Hepatitis B virus：significance of genotypes[J].J Viral Hepat，2005，12（4）：111-124.

[5] 楊艷杰，成軍，陳東風(fēng)，等.乙型肝炎病毒基因分型的臨床意義[J].世界華人消化雜志，2004，12（7）：1670-1673.

[6] Naito H，Hayashi S，Abe K.Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers[J].J Clin Microbiol，2001，39（25）：362-364.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙肝防治指南（續(xù)一）[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，5（13）：493-497.

[8] 王繼榮，周莉，趙洪斌，等.北京地區(qū)乙肝病毒s基因序列多態(tài)性及其分布[J].世界華人消化雜志，2007，15（23）：2496-2502.

[9] 許軍，王齊欣，范春蕾，等.中國南北兩城市乙型肝炎病毒基因型與血清型的構(gòu)成差異[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2003，4（17）：327-329.

[10] 王福青，黃小蕾，李愛琴，等.河南省不同地區(qū)、不同肝病患者的hbv基因型分布[J].山東醫(yī)藥，2008，38（9）：81-82.

[11] 郭瑜，劉曉燕，胡惠梅，等.山西省乙型肝炎病毒基因型別的初步研究[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2006，7（6）：361-363.

[12] Yin J，Zhang H，He Y，et al.Distribution and hepatocellular carcinoma-related viral properties of hepatitis B virus genotypes in Mainland China： a community-based study[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010，19（28）：777-786.

[13] Ding X，Mizokami M，Yao G，et al.Hepatitis B virus genotype distribution among chronic hepatitis B virus carriers in Shanghai， China[J].Intervirology，2001，44（15）：43-47.

[14] Yu M W，Yeh S H，Chen P J，et al.Hepatitis B virus genotype and DNA level and hepatocellular carcinoma： a prospective study in men[J].J Natl Cancer Inst，2005，97（9）：265-272.

[15] Sumi H，Yokosuka O，Seki N，et al.Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease[J].Hepatology，2003，37（6）：19-26.

[16] 胡譚，劉映霞.湖南省乙肝病毒基因型分布及臨床意義[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，40（1）：29-31.

[17] Zeng G，Wang Z，Wen S，et al.Geographic distribution， virologic and clinical characteristics of hepatitis B virus genotypes in China[J].J Viral Hepat，2005，12（95）：609-617.

[18] Li Y J，Zhuang H，Li J，et al.Distribution and clinical significance of hepatitis B virus（HBV） genotypes and subtypes in HBV-infected patients[J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2005，13（6）：724-729.

[19] Lau J Y，Wright T L.Molecular virology and pathogenesis of hepatitis B[J].Lancet，1993，342（45）：1335-1340.

[20] Rehermann B，F(xiàn)owler P，Sidney J，et al.The cytotoxic T lymphocyte response to multiple hepatitis B virus polymerase epitopes during and after acute viral hepatitis[J].J Exp Med，1995，181（13）：1047-1058.

（收稿日期：2012-11-23） （本文編輯：陳丹云）