洪妙玲等

【摘要】 目的：觀察δ-阿片受體激動劑DADLE（[D-Ala2，D-Leu5]enkephali）對大鼠急性全腦缺血再灌注后海馬區(qū)神經(jīng)元ERK信號通路和Caspase-3表達的影響。方法：將50只SD大鼠隨機分為5組：假手術(shù)組（Sham）、模型組（I/R）、DADLE處理組（根據(jù)不同劑量可分為2 mg/kg[A]、3 mg/kg[B]、5 mg/kg[C]）。采用改良的二血管阻斷加低血壓法建立全腦缺血再灌注模型。于缺血15 min后經(jīng)頸外靜脈注射DADLE并于再灌注120 min后處死。開顱取其新鮮海馬組織，采用western blot檢測海馬組織Caspase-3的表達，以及采用免疫組織化學法檢測非磷酸化ERK與磷酸化ERK（P-ERK）的表達狀況。結(jié)果：Sham組ERK和P-ERK蛋白表達水平顯著低于其他各組（P<0.05），DADLE處理組與I/R組相比，其ERK和P-ERK蛋白的表達量明顯上調(diào)（P<0.05）。海馬組織Caspase-3蛋白表達I/R組較Sham組表達明顯上調(diào)（P<0.05），而DADLE處理組與IR組比較，海馬組織 Caspase-3蛋白表達明顯下降（P<0.05）。結(jié)論：DADLE對大鼠急性全腦缺血再灌注后海馬區(qū)神經(jīng)元有保護作用，說明DADLE可通過上調(diào)ERK信號通路以及抑制Caspase-3的表達而起到保護腦組織的作用。

【關(guān)鍵詞】 DADLE； 全腦缺血再灌注； ERK； Caspase-3

近來有研究證實，δ-阿片受體（δ-opioid receptor，DOR）對缺血缺氧神經(jīng)元有保護作用，其中DOR激動劑（[D-Ala2，D-Leu5]enkephalin，DADLE）是目前研究的最為具體、清楚的，且大多數(shù)認為其具有明確的腦保護作用[1]。胞外信號調(diào)控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）調(diào)控多種重要的細胞生物學過程，包括細胞增殖、分化和凋亡等，而Caspase-3是凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶，其含量增加，可引發(fā)細胞凋亡。因此，本研究旨在通過觀察不同劑量的DADLE對大鼠急性全腦缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元ERK信號通路和Caspase-3表達的影響，探討其保護作用的可能分子生物學機制，為DADLE防治急性全腦缺血再灌注損傷的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DADLE購自美國Sigma公司。兔抗大鼠p44/p42MAPK（ERK）、Phospho-p44/42MAPK（Erk1/2）多克隆抗體以及Caspase-3抗體購于美國CST公司。BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)由四川泰盟科技有限公司生產(chǎn)，24G×19 mmY型留置針由威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司提供。

1.2 動物及分組 SD大鼠50只，雌性，體重180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，合格證號SCXK（粵）2008-0020。于廣州醫(yī)學院實驗動物中心喂養(yǎng)，實驗前適應喂養(yǎng)1周。大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham）、模型組（I/R）、DADLE處理組，其中DADLE處理組又分為2 mg/kg（A）、3 mg/kg（B）、5 mg/kg（C）三個亞組，每組各10只。

1.3 二血管阻斷加低血壓建立大鼠全腦缺血再灌注模型 模型組（I/R）大鼠：2%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，取仰臥位固定。切開左側(cè)大腿股部處皮膚，準確分離股動脈后采用靜脈留置針行動脈插管，后以縫線固定，通過Y型留置針注射肝素60 IU/kg達到全身肝素化。右側(cè)股動脈以相同的方法行動脈插管，并與BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)連接，通過生物機能實驗系統(tǒng)監(jiān)測記錄動脈血壓。頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈和左側(cè)頸靜脈，經(jīng)左側(cè)頸靜脈插管建立體外給藥途徑。通過左側(cè)股動脈插管回抽血液至平均動脈壓達30～40 mm Hg，然后用微型動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，進入缺血期。缺血15 min后移去微型動脈夾去除雙側(cè)頸總動脈的夾閉，于左側(cè)股動脈回輸血液至血壓達到正常（回輸速度勻速且緩慢），此為再灌注期，本實驗再灌注期時間為120 min。DADLE處理組：于再灌注前經(jīng)由左側(cè)頸靜注射不同劑量的DADLE（A組2 mg/kg 、B組3 mg/kg 、C組 5mg/kg）。Sham組：除了不進行頸動脈夾閉、不抽血、不給藥外，其余操作同前。

1.4 免疫組織化學法檢測ERK和P-ERK 開顱取大腦經(jīng)生理鹽水漂洗后，將腦組織沿冠狀面對半切開置于4%多聚甲醛固定，脫水后常規(guī)石蠟包埋。將切片脫蠟、脫水，枸櫞酸緩沖液修復抗原，滴加正常山羊血清封閉液，再滴加Phospho-p44/42MAPK多克隆抗體（兔IgG），為濃縮一抗，濃度為1：100，放入濕盒內(nèi)，滴加生物素標記羊抗兔IgG（1%BSA-PBS稀釋），滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素（稀釋和使用方法同二抗），DAB 顯色試劑顯色。組織切片中顯示細胞漿或細胞核有明顯黃棕色顆?；虬咂瑸?ERK陽性。檢測P-ERK的步驟同上。

1.5 western blot蛋白印跡檢測Caspase-3 取30 μg待測樣品及標準蛋白于SDS-PAGE電泳。電泳分離后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用TBST配制5%脫脂牛奶進行封閉，于搖床上室溫孵育60 min。封閉結(jié)束后TBST洗脫3次，每次5 min。按照1∶1000稀釋比例加入Caspase-3一抗，4 ℃孵育過夜，之后TBST洗脫3次，每次5 min。再加入用5%脫脂牛奶（1∶10000）稀釋的二抗，搖床上室溫孵育60 min。孵育結(jié)束后TBST室溫洗脫3次，每次10 min。最后ECL顯色，A液與B液等體積混合，使用X光片曝光，常規(guī)方法顯影定影。結(jié)果運用Image J圖像分析軟件分析，通過計算目的蛋白光密度值與內(nèi)參蛋白光密度值的比值來衡量其表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，不同處理組間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ERK和P-ERK的表達 Sham組ERK和P-ERK陽性細胞數(shù)顯著低于其他各組（P<0.05），A組、B組、C組與I/R組相比，其ERK和P-ERK的陽性細胞數(shù)明顯增加（P<0.05）。而各給藥組之間ERK和P-ERK陽性細胞數(shù)為B組與C組的表達高于A組（P<0.05），B組與C組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1、圖1和圖2。

2.2 各組Caspase-3蛋白表達水平 Caspase-3蛋白表達水平為各組目的條帶的光密度值比上內(nèi)參條帶的光密度值，Sham組值為（0.3022±0.0432），IR組為（0.9857±0.1381），A組值為（0.5469±0.0864），B組值為（0.3941±0.0595），C組值為（0.4177±0.0679）。IR組與Sham組比較，海馬組織Caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)（P<0.05），A組、B組、C組與IR組比較，海馬組織 Caspase-3蛋白表達明顯下調(diào)（P<0.05）。而各給藥組之間海馬組織Caspase-3蛋白表達為B組與C組的表達低于A組（P<0.05），B組與C組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷涉及到谷氨酸的興奮性毒性、梗死周圍去極化、炎癥和延遲性神經(jīng)元死亡等四個機制，均與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路MAPK家族的調(diào)節(jié)有關(guān)[2]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是真核生物中廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。胞外信號調(diào)控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是發(fā)現(xiàn)的第1個MAPK，它調(diào)控多種重要的細胞生物學過程，包括細胞增殖、分化和凋亡等，特異地阻斷ERK通路激活可促進細胞凋亡[3-4]。該激酶被上游蛋白磷酸化后成為活化形式（P-ERK），進一步作用于胞漿內(nèi)多種信號分子或細胞骨架蛋白，并可直接進入核內(nèi)通過作用于轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達[5]。腦缺血再灌注時ERK活性增加是細胞針對缺氧刺激啟動修復過程、促進細胞存活的保護性機制，對于經(jīng)歷了缺血再灌注損傷的神經(jīng)元具有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R組海馬神經(jīng)元ERK和P-ERK的表達均較Sham組顯著升高，DADLE處理后ERK和P-ERK的表達又較I/R組顯著升高，而該保護作用是否與DADLE劑量有明顯相關(guān)，則需作進一步研究。

Caspase家族是哺乳動物凋亡機制中關(guān)鍵因素，而Caspase-3被認為是此級聯(lián)反應中最關(guān)鍵效應的蛋白酶。正常情況下，胞質(zhì)中Caspase-3以無活性酶形式存在，被凋亡信號激活后斷裂為大小兩個亞基并結(jié)合為四聚體，成為活性酶，活性的Caspase-3進一步切割不同底物，導致蛋白酶切割聯(lián)放大，DNA裂解，最終使細胞走向死亡[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R組海馬神經(jīng)元Caspase-3即有大量表達，DADLE處理后Caspase-3的表達均減少，而該保護作用是否與DADLE劑量有明顯相關(guān)，則需要作進一步研究。

研究證實，δ阿片受體激動劑DADLE對大鼠全腦缺血再灌注損傷有保護作用[8]，DADLE成為近年來研究神經(jīng)保護的領(lǐng)域中的熱點。韓潔韻等[9]初步研究發(fā)現(xiàn)，DADLE對全腦缺血再灌注損傷具有保護作用，但其具體保護機制報道較少。本研究結(jié)果表明，DADLE處理組較缺血再灌注組的ERK和p-ERK升高明顯（P<0.05），提示DADLE可能通過調(diào)節(jié)ERK和p-ERK的表達起到保護腦組織的作用。Caspase-3是凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶，Caspase-3蛋白含量增加，可引發(fā)細胞凋亡。本實驗研究證明，SD大鼠腦缺血再灌注損傷后應用DADLE治療可明顯抑制Caspase-3的升高（P<0.05），說明DADLE可通過抑制Caspase-3的活性升高而起到保護腦組織的作用。

綜上所述，DADLE對大鼠急性全腦缺血再灌注后海馬區(qū)神經(jīng)元有保護作用，可能與其上調(diào)ERK信號通路以及抑制Caspase-3的表達有關(guān)。除此外DADLE是否還參與了其他的途徑來降低神經(jīng)元細胞的損傷還有待進一步深入研究。

參考文獻

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[9] 韓潔韻，梁子敬.δ阿片受體激動劑DADLE對全腦缺血再灌注大鼠大腦組織病理影響[J].廣州醫(yī)學院學報，2008，36（5）：1-4.

（收稿日期：2012-11-21） （本文編輯：陳丹云）