姜遠紅，高 充(山西醫(yī)科大學(xué)細胞生理學(xué)省部共建教育部重點實驗室，太原 03000;山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究所; 通訊作者，E－mail:gcprimg@gmial.com)

由于二型糖尿病(T2DM)與老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)存在的相似病理特征［1］，使得利用糖尿病模型誘導(dǎo)認知功能障礙成為可能。二者間的相關(guān)性包括:同為老化退行性病變，高膽固醇危險因素，相似的代謝功能紊亂，相似的β淀粉樣蛋白(amyloid，protein，Aβ)堆積，以及細胞內(nèi)信號途徑的失調(diào)如糖原合成酶激酶3(GSK3)的過度活化等［2，3］。腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozcin，STZ)可以誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗(insulin resistance)癥狀，這被認為是誘導(dǎo)糖尿病實驗動物模型的經(jīng)典方法［4］。而STZ的側(cè)腦室注射大鼠，則已經(jīng)被廣泛證明可以成功誘導(dǎo)出大鼠AD樣病理變化，這一系列變化包括:行為學(xué)改變、電生理改變(長時程增強的壓抑)、細胞外β淀粉樣蛋白的聚集(Aβ)，以及細胞內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化等［5－8］。相同藥物的外周給予和中樞給予能誘導(dǎo)兩類不同的疾病，這也從另一個側(cè)面證實了T2DM與AD的密切聯(lián)系。本實驗基于STZ的神經(jīng)毒性作用，利用投射電子顯微鏡(TEM)觀察STZ側(cè)腦室注射后大鼠海馬神經(jīng)元與對照組的差異，旨在研究中樞注射STZ對大鼠海馬的超微結(jié)構(gòu)變化的影響，從而探索在由于胰島素功能異常所引發(fā)的AD情況下，海馬神經(jīng)元的超微病理學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡雄性SD大鼠(240－270 g)(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)12只被平均隨機分為對照組和STZ組(n=6每組)。實驗動物的飼養(yǎng)采取自由取食取水，恒溫恒濕狀態(tài)，溫度為室溫。采取12 h黑暗光照循環(huán)。

1.2 實驗試劑

對照組側(cè)腦室注射所用人工腦脊液(aCSF:NaCl 140 mmol/L;KCl 3.0 mmol/L;CaCl22.5 mmol/L;MgCl21.2 mmol/L;NaH2PO41.2 mmol/L，pH 7.4)，實驗組大鼠側(cè)腦室注射 STZ(Sigma公司，3 mg/kg，溶于 aCSF中)。大鼠腹腔注射麻醉用藥10%水合氯醛。組織固定所需試劑:2.5%的戊二醛，二甲砷酸鈉緩沖液(0.1 mol/L;pH 7.4)。

1.3 實驗器材

大鼠側(cè)腦室注射所需器材:注射器，手術(shù)刀，手術(shù)剪，微量注射器(5 μl)，非吸收縫合針線，大鼠立體定位儀(深圳瑞沃德公司)，顱骨鉆。

電鏡觀察:LKB超薄切片機，JEOL 1101電子顯微鏡。

1.4 實驗方法

側(cè)腦室注射:10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于大鼠立體定位儀，顱骨鉆開顱，定位前囟點后0.8 mm，旁開1.5 mm，深度3.6 mm，單側(cè)側(cè)腦室注射10 μl(aCSF或STZ溶液)，術(shù)后恢復(fù)2周。

投射電鏡觀察:大鼠海馬電鏡切片的制作遵循本研究室之前的方法［6］。大鼠以10%水合氯醛腹腔過量麻醉，斷頭后取腦并剝離海馬。海馬切片在2.5%的戊二醛內(nèi)固定2.5 h(4 ℃)，0.1 mol/L 二甲砷酸鈉緩沖液中(pH 7.4)洗滌兩次，每次10 min，1%四氧化二鋨后固定2 h，丙酮系列脫水(30%，50%，70%，80%，90%，95%停留 5－10 m;100%丙酮三次，每次5－10 m)，環(huán)氧樹脂618包埋，LKB超薄切片機切片(厚度500 ?)，醋酸鈾－檸檬酸鉛雙染色，JEOL－1101電子顯微鏡觀察(日本電子)。

2 結(jié)果

2.1 STZ誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元細胞超微結(jié)構(gòu)改變

對照組大鼠海馬神經(jīng)元表現(xiàn)出了完整的細胞結(jié)構(gòu)(圖1A，B)。而STZ處理后，大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)了各種細胞結(jié)構(gòu)變化。STZ組大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)了核周隙增寬，部分核膜消失(圖1C，D箭頭)，以及細胞器變化，如線粒體部分溶解(圖1D，箭頭);STZ還誘導(dǎo)出了大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的變化，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間隙的增寬(圖1E，箭頭)，另外STZ組大鼠某些大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)了核仁的分離(圖1F，箭頭)。STZ的處理組除出現(xiàn)了一些異常早期細胞超結(jié)構(gòu)變化外，還顯示出了一些嚴(yán)重的超微結(jié)構(gòu)損傷，如核周隙的嚴(yán)重擴大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重損傷(圖1G，箭頭)，以及除核結(jié)構(gòu)以外其他胞質(zhì)結(jié)構(gòu)如線粒體完全被降解(1H)。

圖1 STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 (Bar=1 μm)Fig 1 Ultrastructure of hippocampal neurons in STZ-induced rats (Bar=1 μm)

2.2 STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)的變化以及核蛋白體變化

STZ還誘導(dǎo)了海馬神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)的變化，其中最主要的變化就是突觸囊泡的異常聚集。在對照組中大鼠海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)正常，并且囊泡數(shù)量正常(圖2A)，而STZ組大鼠海馬神經(jīng)元突觸末端則出現(xiàn)了大量聚集的囊泡(圖2B)。此外，STZ組大鼠海馬神經(jīng)元還出現(xiàn)了核蛋白體的異常聚集(圖2C，D)，而這種異常聚集也合并了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間隙的增寬(圖2C)。

圖2 STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的變化Fig 2 Changes of synaptic structure of hippocampal neurons in STZ-induced rats

3 討論

海馬是AD病變過程中主要受損的區(qū)域，并且早已有研究證實STZ的側(cè)腦室注射能夠引起海馬內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)的退行性變及其動物學(xué)習(xí)記憶能力的下降［9］。本研究中，我們利用了TEM手段直接觀察STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元的超微病理學(xué)變化，并且我們發(fā)現(xiàn)了STZ單次側(cè)腦室注射誘導(dǎo)出了大鼠海馬神經(jīng)元的早期AD樣超微結(jié)構(gòu)變化，如細胞核結(jié)構(gòu)改變，包括核周隙增寬，部分核膜消失甚至出現(xiàn)了核仁分離現(xiàn)象。這一系列細胞超微結(jié)構(gòu)的某些異常提示了海馬神經(jīng)元正在經(jīng)歷早期細胞凋亡過程以及氧化應(yīng)激反應(yīng)［10］，甚至出現(xiàn)了細胞亞結(jié)構(gòu)的溶解現(xiàn)象。而在突觸結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的大量囊泡，提示了異常的突觸興奮性，這一現(xiàn)象提示早期的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且這種異常興奮性可能與早期AD病人的部分癲癇樣或狂躁型病例相關(guān)［11，12］。而這一系列的超微結(jié)構(gòu)變化為STZ誘導(dǎo)的大鼠其他方面的AD樣病理變化如行為學(xué)和電生理變化提供了一定的超微結(jié)構(gòu)支持。

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