吳春平，王國紅，張 勇，李東亮

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學與神經生物學教研室，河南新鄉(xiāng)453003）

孕酮（progesterone，PROG）是性腺分泌的甾體激素，現在發(fā)現它也可在神經系統(tǒng)生成并影響神經系統(tǒng)結構和功能，被稱為神經活性甾體（neuroactive steroid）。本實驗室先前已經證明PROG可減輕大鼠腦缺血／再灌注損傷（ischemia／reperfusion injury，IRI）引起的腦水腫，降低血腦屏障通透性，促進腦IRI大鼠的行為恢復［1］。最近本室在體外培養(yǎng)的PC12細胞證明孕酮可減輕氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）對神經元的損傷。然而孕酮的防護作用是通過核受體介導的基因途徑，還是通過膜受體介導的非基因途徑目前尚不清楚［2］。本文在PC12細胞的OGD損傷模型，觀察孕酮核受體拮抗劑米非司酮（mifepristone，MIF）阻斷孕酮核受體前后細胞形態(tài)、存活率、培養(yǎng)液中葡萄糖含量的變化，探討核受體介導的基因途徑在孕酮抗OGD損傷中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞株購于上海中科院細胞庫。神經生長因子（nerve growth factor，NGF）購自美國 Invintrogen公司；DMEM培養(yǎng)基（無糖、無酚紅）、孕酮、米非司酮和2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-5-［（phenylamino）carbonyl］-2H-tetrazolium hydroxide（XTT）購于美國 Sigma公司；葡萄糖測定試劑盒購于上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和實驗分組

PC12細胞采用含10%胎牛血清、100 U／ml芐青霉素和100 U／ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分數5%CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)，取對數生長期細胞進行實驗。實驗分5組，正常對照組（normal）：常氧常糖培養(yǎng)；OGD模型組（model）：接種24 h后行OGD處理30min，后復氧復糖培養(yǎng)24 h；PROG組：OGD和復氧復糖期間培養(yǎng)基中含10 nmol／L孕酮，余同 model組；PROG＋MIF組：10μmol／L MIF預處理 30 min后，按PROG組操作進行；MIF組：不行PROG處理，余同PROG＋MIF組。各組按上述處理后進行各指標檢測。

1.3 PC12細胞OGD模型制備

參照文獻［3］對PC12細胞進行氧糖剝奪處理。細胞培養(yǎng)液更換為無糖無酚紅DMEM培養(yǎng)基后，放入低氧艙中，快速充入含95%N2、5%CO2混合氣體，低氧艙氧濃度低于1%開始計時，持續(xù)低氧30 min，低氧過程中環(huán)境溫度維持在37℃。

1.4 HE染色觀察細胞形態(tài)

細胞以5×104cells／ml的密度接種于24孔板中，接種24 h后隨機分組并按上述操作行各組處理，倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化，然后行HE染色。

1.5 XTT法檢測細胞活力

細胞以5×104cells／ml的密度接種于96孔板，24 h后隨機分組，每組設5復孔，各組行上述處理。XTT檢測時，每孔加入預溫37℃50μl的XTT工作液，培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育2 h。然后用ELX-800（Bio-Tek）酶標儀檢測各孔吸光度值，測定波長450 nm，參考波長650 nm。計算各組細胞活力（Viability）。計算公式如下：細胞活力＝（實驗組吸光度－空白組吸光度）／（對照組吸光度－空白組吸光度）×100%

1.6 臺盼藍拒染試驗計數活細胞

各組細胞用0.25%胰蛋白酶消化30 s，完全培養(yǎng)基終止消化，吹打成的單細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液1∶1混勻，臺盼藍著色的細胞為死細胞，活細胞計數儀計數每毫升細胞懸液中活細胞數（viable count）。

1.7 葡萄糖含量的測定

每孔取10μl培養(yǎng)液，用氧化酶法測定培養(yǎng)基中葡萄糖含量，嚴格按試劑盒操作流程進行。試驗結果的計算方法：葡萄糖（mmol／L）＝樣本吸光度（A）／校準吸光度（A）×校準液濃度。

1.8 統(tǒng)計學處理

所有數據以均數±標準差（±s）表示，采用 SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組之間顯著性檢驗用單因素方差分析，兩兩比較均采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 米非司酮對孕酮防護氧糖剝奪PC12細胞形態(tài)的影響

倒置鏡下normal組PC12細胞多呈梭型或三角形，折光性強，兩極伸出較長突起，部分突起可發(fā)出分枝并交織成網狀；HE染色顯示，與normal組相比model組細胞皺縮變圓，折光性下降，突起減少或消失，部分細胞裂解成碎片，細胞密度明顯降低，胞質濃縮，胞核固縮呈黑色，細胞邊集，中央細胞稀疏。PROG組細胞大部分仍呈梭形，胞體皺縮減輕，仍有細短突起，細胞密度較model組增加。PROG＋MIF組和MIF組的細胞形態(tài)和密度與model組相似，表明MIF可阻斷孕酮改善OGD細胞形態(tài)損傷的作用。

2.2 米非司酮對孕酮防護氧糖剝奪PC12細胞活力的影響

XTT法檢測細胞活力結果顯示，model組細胞活力明顯低于 normal組（P＜0.01），PROG組則顯著高于 model組（P＜0.01），PROG＋MIF組和MIF組的細胞活力明顯低于PROG組（P＜0.05），而與 model組無顯著性差異（P＞0.05）。孕酮可顯著提高OGD后PC12細胞活力，具有較好的防護作用，而米非司酮阻斷了孕酮91.8%±3.2%的防護作用 （表1）。

2.3 米非司酮對孕酮防護氧糖剝奪PC12活細胞數的影響

Model組的活細胞數明顯低于 normal組（P＜0.05）。PROG組的活細胞數較model組顯著增多（P＜0.05）。PROG＋MIF組的活細胞數與model組無明顯差異（P＞0.05），顯著低于孕酮組 （P＜0.05），米非司酮拮抗了孕酮 85.0%±2.6%的作用。MIF組與model組、PROG＋MIF組之間均無顯著差異（P＞0.05，表 1）。

2.4 孕酮和米非司酮對氧糖剝奪PC12細胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量的影響

Model組細胞培養(yǎng)基中的葡萄糖含量顯著高于normal組（P＜0.05）。PROG組明顯低于 model組 （P＜0.05）。PROG＋MIF組和MIF組明顯高于PROG組 （P＜0.05），與model組相比無明顯差異（P＞0.05，表 1）。

Tab.1 Effects of progesterone and mifepristone on cell viability，viable count and glucose content in themedium

3 討論

傳統(tǒng)認為孕酮可通過位于細胞質和核內的受體，刺激基因轉錄和蛋白質合成，產生基因效應。近年來的研究表明孕酮也可通過膜受體將細胞外信號傳遞給胞內第二信使，發(fā)揮非基因效應。目前雖然在很多物種克隆出孕酮膜受體的cDNA和重組蛋白，然而膜受體的本質到現在還不完全明確。我們前期工作表明孕酮可以增加氧糖剝奪PC12細胞的葡萄糖轉運體GLUT3的表達，減少PC12細胞的死亡［4］。但它是通過基因效應，還是通過非基因效應目前并不明了，國內外也少有報道。人工合成的米非司酮（RU486）是孕酮的特異性核受體阻斷劑，對孕酮核受體有很高的親和力，拮抗孕酮的作用很強，常被用于研究甾體激素受體作用機制的工具藥［5］。本實驗證明PROG組細胞活力顯著高出OGD模型組（P＜0.01），而預先用孕酮的核受體阻斷劑米非司酮處理則可顯著拮抗孕酮的作用，細胞活力下降到model組水平（P＞0.05），米非司酮對孕酮的阻斷作用達 91.8%±3.2%。臺盼藍拒染試驗計數活細胞結果與XTT檢測結果一致，米非司酮可阻斷孕酮85.0%±2.6%的作用。用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，可間接反映細胞對葡萄糖的消耗情況。結果表明model組培養(yǎng)基中的葡萄糖含量顯著增高，PROG組則顯著降低，PROG＋MIF組明顯升高，表明孕酮減少細胞死亡，增加了葡萄糖的消耗，而這種防護作用被米非司酮所拮抗。上述結果表明孕酮對OGD損傷PC12細胞的防護作用可能主要是通過核受體介導的基因效應實現的。

［1］ 李東亮，趙紅崗，王東霞，等.孕酮對腦缺血再灌注大鼠紋狀體水、鈉、鉀及鈣含量的影響［J］.中國病理生理雜志，2001，17（10）：1012-1015.

［2］ Kilic F，Kashikar N D，Schmidt R，et al.Caged progesterone：a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone［J］.J Am Chem Soc，2009，131（11）：4027-4030.

［3］ Li H，Hu J，Ma L，et al.Comprehensive study of baicalin down-regulating NOD2 receptor expression of neurons with oxygen-glucose deprivationin vitroand cerebral ischemiareperfusionin vivo［J］.Eur JPharmacol，2010，649（1-3）：92-99.

［4］ 侯志慧，王國紅，吳春平，等.孕酮對氧糖剝奪損傷的PC12細胞的防護作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28（2）：269-273.

［5］ Butts C L，Shukair SA，Duncan K M，et al.Progesterone inhibitsmature rat dendritic cells in a receptor-mediated fashion［J］.Int Immunol，2007，19（3）：287-296.