黃姣艷， 程小娥， 馬龍先， 張達(dá)穎， 蔣昌宇， 柳 濤3，△

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1麻醉科，2疼痛科，3醫(yī)學(xué)科研中心，江西南昌330006；4深圳市南山醫(yī)院韓濟生院士疼痛醫(yī)學(xué)工作站，廣東深圳518052）

超級化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels，HCN channels）有HCN1～4共4種亞型，主要表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞的胞膜上，與癲癇、抑郁、疼痛以及心臟疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)［1-4］。脊髓背角（spinal dorsal horn，SDH）是外周傷害性信息向中樞傳遞的初級門戶，該區(qū)域的HCN通道已被證實在慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。例如大鼠脊髓背角HCN2的表達(dá)在慢性炎性痛后顯著增加，而阻斷或抑制HCN通道可大幅減輕神經(jīng)病理性疼痛和炎性痛模型動物的痛行為［5-7］。SDH由淺至深分為Ⅰ～Ⅵ層，其中Ⅰ～Ⅱ?qū)訕?gòu)成脊髓背角淺層，對疼痛的傳遞與整合起著重要的調(diào)控作用。我們近期研究初步表明，HCN通道在脊髓背角淺層廣泛表達(dá)，且HCN4與興奮性軸突末梢標(biāo)志物囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體2（vesicular glutamate transporter 2，VGLUT2）顯著共染［8-9］，但HCN通道在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的具體表達(dá)情況及在神經(jīng)元亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如樹突、軸突等部位的分布尚不清楚。因此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)和激光共聚焦成像技術(shù)，觀察SDH中HCN通道的4種亞型在正常大鼠脊髓背角淺層的特異性分布情況，以期為進(jìn)一步揭示SDH的HCN通道在痛信號通路中的作用提供參考資料。

材料和方法

1 動物

3～5周齡清潔級 Sprague-Dawley（SD）大鼠 27只，體重80～100 g，雌雄不拘，來源于南昌大學(xué)動物中心［許可證號為SYXK（贛）2005-0001］。動物實驗嚴(yán)格遵循《南昌大學(xué)實驗動物管理辦法》和《南昌大學(xué)動物實驗倫理審查》的原則進(jìn)行。實驗大鼠飼養(yǎng)于清潔籠具中，室內(nèi)光照保持12 h/12 h晝夜循環(huán)，室溫控制在20～25℃，相對濕度在65%～70%之間，自由飲食。

2 主要試劑及儀器

抗HCN1～4抗體購自Alomone Labs；抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、抗降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin generelated peptide，CGRP）抗體和抗軸突神經(jīng)絲SMI-312抗體購于Abcam；抗神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）抗體和抗囊泡γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運體（vesicularγaminobutyric acid transporter，VGAT）抗體購于 Synaptic Systems；抗小膠質(zhì)細(xì)胞抗體（CD11b/c，OX-42）和抗VGLUT2抗體購自Millipore；抗異凝集素B4（isolectin B4，IB4）抗體購于Vector Labs；Alexa Fluor（AF）488、AF546、AF555和AF647標(biāo)記的熒光Ⅱ抗均購于Molecular Probes；Cy5和rhodamine標(biāo)記的熒光Ⅱ抗購于Jackson ImmunoResearch Labs；冰凍切片機（CM1950）購自Lecia。激光共聚焦顯微鏡（LSM700）及圖像分析軟件（ZEN 2010）購自 Carl Zeiss。

3 主要方法

3.1 免疫組織化學(xué)染色脊髓切片制備 給大鼠腹腔注射烏拉坦（1.5 g/kg）麻醉后開胸暴露心臟，用預(yù)冷的0.9%NaCl 100 mL行心臟灌流，再以4%多聚甲醛（pH 7.4，4℃）150 mL灌注固定，灌畢立即剪開大鼠背部皮膚，分離脊柱兩側(cè)肌肉、離斷兩側(cè)肋骨，取出連同脊髓的脊柱，并完全浸入4%多聚甲醛中。以腹側(cè)入路切除椎板，以腰骶膨大部為中心游離出脊髓（腰1～骶3），于顯微鏡下剝離脊髓表面硬脊膜、軟脊膜及附著神經(jīng)根。取出脊髓放入4%多聚甲醛中固定6 h，充分漂洗后置于30%蔗糖溶液3 d（4℃），取出脊髓，切去脊髓頭尾，留取L4～L5腰骶膨大部，OCT包埋劑包埋，用冰凍切片機連續(xù)橫向切片（片厚30 μm），放置于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）液中存放，按下述方法進(jìn)行免疫熒光染色。

3.2 免疫熒光組織化學(xué)染色方法 將上述脊髓橫切片在0.01 mol/L PBS液中充分漂洗后進(jìn)行常規(guī)漂染：Ⅰ抗 HCN1～4（1∶200）分別與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN（1∶200）、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP（1∶2 000）、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物OX-42（1∶200）、非肽能初級傳入軸突末梢標(biāo)志物IB4（1∶100）、肽能初級傳入軸突末梢標(biāo)志物CGRP（1∶100）、神經(jīng)元樹突標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2；1∶1 000）、神經(jīng)元軸突標(biāo)志物 SMI-312（1∶1 000）和抑制性中間神經(jīng)元軸突末梢標(biāo)志物VGAT（1∶1 000）進(jìn)行共染，于4℃搖床上孵育3 d。挑出脊髓片用PBS漂洗3次，每次5 min，加入與Ⅰ抗種屬對應(yīng)的Ⅱ抗 AF488（1∶500）、AF546（1∶400）、AF555（1∶400）、AF647（1∶400）、rhodamine（1∶1 000）和Cy5（1∶400）于4℃搖床上孵育過夜，取出脊髓片充分漂洗后封片。用激光共聚焦顯微鏡采集10倍（×10）、40倍（×40）及63倍（×63，油鏡）的圖像進(jìn)行分析處理，根據(jù)實際情況調(diào)節(jié) Z值（0.5～1 μm）。HCN1～4抗體的特異性已在我們之前的研究中得到驗證［9］。

3.3 熒光定量分析 采用ZEN 2010分析軟件自帶的熒光定量功能，測定HCN1～4在SDHⅠ～Ⅱ?qū)觾?nèi)側(cè)帶、中側(cè)帶和外側(cè)帶的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI），圖像均取自同一放大倍數(shù)（×10，zoom=1），從每只大鼠切取的脊髓片中隨機挑取2～3張，在兩側(cè)背角Ⅰ～Ⅱ?qū)觾?nèi)、中、外側(cè)帶各取150 pixel×150 pixel正方形方框并測量方框內(nèi)的MFI，再取同樣大小的方框置于空白處以測定背景MFI，用來標(biāo)準(zhǔn)化HCN1～4的MFI（兩者相減），取均值作為其MFI。采用上述同種方法，圖像取同一放大倍數(shù)（×10，zoom=0.5），定量分析HCN1～4在脊髓灰質(zhì)各層（Ⅰ～Ⅱ?qū)?、Ⅲ～Ⅳ層和Ⅴ～Ⅵ層）及白質(zhì)內(nèi)的MFI。

3.4 共定位分析 采用ZEN 2010分析軟件自帶的共染定量分析功能，測定并分析HCN1～4分別與SDH Ⅰ～Ⅱ?qū)痈鳂?biāo)志物NeuN、GFAP、OX-42、MAP2、SMI-312、CGRP、IB4和VGAT的共定位情況。圖像均取自同一放大倍數(shù)（×40，zoom=1），從每只大鼠切取的脊髓片中隨機挑取2～3張，統(tǒng)計每張脊髓片兩側(cè)背角內(nèi)、中、外側(cè)帶400 pixel×400 pixel正方形方框內(nèi)HCN1～4分別與各標(biāo)志物的共定位系數(shù)，并取其均值作為最終共定位系數(shù)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗后，兩組獨立樣本間的比較采用兩獨立樣本t檢驗，3組及以上樣本間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HCN通道在脊髓的大體分布

采用免疫組化染色方法，觀察HCN1～4在脊髓中的分布模式，結(jié)果顯示HCN通道的4種亞型均在脊髓灰質(zhì)中表現(xiàn)出較強的熒光信號，而在白質(zhì)中熒光信號微弱，見圖1A～D。進(jìn)一步熒光定量分析結(jié)果顯示HCN1～4在脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)觾?nèi)側(cè)帶、中側(cè)帶和外側(cè)帶的MFI無顯著差異（P＞0.05），見圖1E。

Figure 1.Distribution of HCN1～4 in the spinal cord.A～D：representative images of immunolabeling of HCN1，HCN2，HCN3 and HCN4 in the spinal cord（scale bar=200μm）；A1～D3：the enlargements of the areas showing in the box in A～D（from top to bottom），respectively（scale bar=20 μm）；E：the mean fluorescence intensity（MFI）of HCN1～4 in the lateral，central and medial dorsal horn.Mean±SEM.n=11.圖1 HCN通道亞型在脊髓的大體分布

此外，HCN2～4主要集中分布在脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)?，其MFI與其它各層及白質(zhì)之間均有顯著性差異（P＜0.01）；而HCN1灰質(zhì)MFI雖與白質(zhì)的MFI相比有顯著差異（P＜0.01），但其Ⅰ～Ⅱ?qū)覯FI與其它各層的MFI相比，無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 HCN1～4在脊髓背角Ⅰ～Ⅵ層和白質(zhì)中分布的平均熒光強度Table 1.The MFIof HCN1～4 in laminaeⅠ～Ⅵ and white matter of the spinal cord（Mean±SEM）

2 HCN通道在脊髓背角神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞上的分布

為明確HCN1～4蛋白表達(dá)的細(xì)胞類型，我們觀察了HCN1～4與NeuN和GFAP、OX-42的共染情況，見圖2及表2、3。有11.2%的GFAP、8.7%的OX-42和4.8%的NeuN與HCN1共染；31.7%的NeuN和5.8%的GFAP與HCN2共染，OX-42與HCN2共染少（3%）；38.6%的NeuN與HCN3共染，而GFAP和OX-42與HCN3幾乎無共染（均＜1%）；7.2%的GFAP與HCN4共染，NeuN和OX-42與HCN4共染少（分別為1.5%和5%）。此外，NeuN與HCN1～4的共染占HCN1～4的百分比分別為12.6%、45.6%、64.7%和2.2%，GFAP與HCN1～4的共染占HCN1～4的百分比分別為5.2%、2.3%、0.4%和3%，OX-42與HCN1-4的共染占HCN1～4的百分比分別為3.5%、1.3%、0.4%和1.6%。

3 HCN通道在脊髓背角初級傳入神經(jīng)末梢的分布

通過檢測HCN通道在脊髓背角初級傳入神經(jīng)末梢的分布觀察到IB4與HCN4存在共染，而與HCN1～3幾乎不共染，見圖3A。CGRP與HCN2和HCN4存在共染，與HCN1和HCN3不共染，見圖3B。

定量分析結(jié)果表明，IB4和CGRP與HCN通道各亞型共定位存在顯著差異（P＜0.05），其中6.7%的IB4與HCN4共染，9.2%的CGRP與HCN2共染，IB4、CGRP與HCN1共染少（分別為1.1%和2.1%），而IB4和CGRP與HCN3均無共染（分別為0.3%和0.9%），見表2。此外，9.5%的HCN4與IB4共染，6.3%的HCN2與CGRP共染，見表3。

4 HCN通道在脊髓背角中間神經(jīng)元樹突和軸突的分布

HCN1、HCN4與MAP2存在共染，HCN2、HCN3與MAP2幾乎無共染；SMI-312與HCN1～4共染均不顯著，見圖4。

定量分析結(jié)果顯示，6%和8.7%的MAP2分別與HCN1和HCN4共染，MAP2與HCN2和HCN3的共染系數(shù)分別為2.8%和0.5%；SMI-312與HCN1～4的共染系數(shù)分別為3.8%、1.2%、0.5和4.4%，見表2。此外，8.9%的HCN4與MAP2共染，而2%的HCN1與SMI-312共染，見表3。

5 HCN通道在脊髓背角中間神經(jīng)元軸突末梢的分布

為明確HCN1～4在抑制性軸突末梢的分布情況，我們將其與抑制性中間神經(jīng)元軸突末梢標(biāo)志物VGAT共染，見圖5。

定量分析結(jié)果顯示，15.9%的VGAT與HCN4共染，而VGAT與HCN1～3幾乎不共染（分別為2.3%、1.6%和0.5%）；同時14.7%的HCN4共表達(dá)VGAT，見表2、3。

討 論

1 HCN通道在脊髓的大體分布

背角淺層是傷害性信息由外周傳入高級中樞的第一個中繼站，Ⅰ層由投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元組成，Ⅱ?qū)拥腟G區(qū)則是“閘門控制理論”的核心組成部分，閘門的開放與關(guān)閉決定了疼痛信息能否繼續(xù)向上傳遞，在慢性疼痛的發(fā)生與發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用［10-12］。因此，HCN通道在脊髓背角淺層的表達(dá)尤為被學(xué)者們關(guān)注。在成年雄性Wistar大鼠或C57BL/6小鼠中，HCN2主要位于脊髓背角的Ⅰ和Ⅱ外層（Ⅱo）［13-14］，HCN4 則主要位于Ⅰ和Ⅱ內(nèi)層（Ⅱi）［15］。與上述結(jié)果一致，我們近年已發(fā)表的工作表明HCN亞型在脊髓背角Ⅰ～Ⅵ各層均有分布，且以Ⅰ～Ⅱ?qū)訛橹鳎?］。由于SG神經(jīng)元隨著放電模式的不同，在脊髓背角呈現(xiàn)不同的分布模式，如適應(yīng)性放電神經(jīng)元主要分布在SG區(qū)的外側(cè)帶［16］。因此，有必要明確HCN1～4在脊髓背角淺層的內(nèi)、中、外側(cè)帶是否存在差異性表達(dá)。本研究結(jié)果顯示它們之間的分布無顯著差異，進(jìn)一步的定量分析顯示，HCN2～4在脊髓背角的分布主要以Ⅰ～Ⅱ?qū)訛橹?。由于Ⅰ～Ⅱ?qū)优c痛信號的傳遞密切相關(guān)，因此HCN通道在該區(qū)域的高表達(dá)表明其在疼痛的調(diào)制中可能具有重要的作用。

Figure 2.Specific localization of HCN isoforms in different cell types in spinal dorsal horn.A：representative images of co-immunostaining for HCN1～4（green）and NeuN（red）in superficial spinal dorsal horn；B：representative images of co-immunostaining for HCN1～4（green），GFAP（blue）and OX-42（red）in superficial spinal dorsal horn.圖2 HCN亞型在脊髓背角細(xì)胞中的特異性表達(dá)

2 HCN通道在脊髓背角細(xì)胞水平上的分布

Figure 3.Distribution of HCN isoforms in the primary afferent nerve endings of the spinal dorsal horn.Representative images of coimmunostaining for HCN1～4（green），IB4（blue）and CGRP（red）in superficial spinal dorsal horn were shown.圖3 HCN通道各亞型在脊髓背角初級傳入神經(jīng)末梢的分布

脊髓背角主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成，后者主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。活化的膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放多種炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素1β等致神經(jīng)病理性疼痛膠質(zhì)細(xì)胞的激活是神經(jīng)痛發(fā)病的重要因素，葛根素［17］及小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素［18］等可減少這些致痛物質(zhì)的生成以有效緩解疼痛。我們已發(fā)表的研究觀察到米諾環(huán)素可在數(shù)分鐘內(nèi)顯著降低SG神經(jīng)元的HCN通道介導(dǎo)的電流（Ih）的振幅從而降低其興奮性［19］，證實了米諾環(huán)素鎮(zhèn)痛的神經(jīng)機制。那么米諾環(huán)素有無可能通過作用于膠質(zhì)細(xì)胞的HCN通道而發(fā)揮作用呢？在大鼠的大腦皮質(zhì)和海馬中，Honsa等［20］檢測到這兩個區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞在生理情況下表達(dá)極少量的HCN1～3，在缺血刺激下，這些細(xì)胞的HCN1～3可顯著增加，而HCN4在生理和病理情況下均未發(fā)現(xiàn)有表達(dá)。但是，HCN通道在脊髓背角的膠質(zhì)細(xì)胞是否存在表達(dá)尚不明確。本研究首次揭示正常情況下脊髓背角的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)HCN1、HCN2和HCN4通道，而HCN3與星形膠質(zhì)細(xì)胞無共定位。由于病理性疼痛狀態(tài)下星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活，HCN通道的表達(dá)有可能如上述缺血刺激亦大幅上升，從而加重疼痛。另一方面，雖然脊髓背角HCN1與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物OX-42存在少量共染，但其余3種亞型與OX-42均幾乎無共定位，表明小膠質(zhì)細(xì)胞的HCN通道對疼痛的作用有限。此外，多個電生理研究均已在背角淺層神經(jīng)元上記錄到Ⅰh［19，21］，本研究觀察到NeuN共染較多的亞型為HCN2和HCN3。研究表明，脊髓背角淺層的神經(jīng)元多為中間神經(jīng)元［22］，84.1%小清蛋白陽性神經(jīng)元和53.9%的PKCγ陽性神經(jīng)元被檢測有HCN4表達(dá)［15］，此外，HCN4還被檢測到表達(dá)在不含鈣結(jié)合蛋白的Pax2陽性的背角Ⅱ?qū)由窠?jīng)元中［23］。目前HCN通道在SDH中間神經(jīng)元的定位尚不完全清楚，進(jìn)一步研究HCN通道在脊髓背角中間神經(jīng)元亞群中的分布，對闡明HCN通道在神經(jīng)病理性疼痛和炎性痛中的作用具有至關(guān)重要的作用。

Figure 4.Distribution of HCN isoforms in dendrites and axons of interneurons in spinal dorsal horn.A：representative images of coimmunostaining for HCN1～4（green）and MAP2（red）in superficial spinal dorsal horn；B：representative images of co-immunostaining for HCN1～4（green）and SMI-312（red）in superficial spinal dorsal horn.圖4 HCN通道亞型在脊髓背角神經(jīng)元樹突和軸突中的分布

Figure 5.Distribution of HCN isoforms at axonal terminal of inhibitory interneurons in spinal dorsal horn.Representative images of co-immunostaining for HCN1～4（green）and VGAT（red）in superficial spinal dorsal horn were shown.圖5 HCN通道亞型在脊髓背角抑制性中間神經(jīng)元軸突末梢的分布

3 HCN通道在脊髓背角神經(jīng)元亞細(xì)胞水平上的分布

脊髓背角接收來自初級傳入軸突的輸入信號，其遞質(zhì)主要有肽能（P物質(zhì)和CGRP）和非肽能（IB4）兩種。IB4陽性的傳入神經(jīng)纖維不參與正常的機械傷害感受，但能被炎癥刺激致敏并在介導(dǎo)機械性炎癥超敏反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［24］。而CGRP標(biāo)記陽性的肽能初級傳入神經(jīng)元也與炎癥性疼痛相關(guān)［3］。以往研究表明，HCN2主要與CGRP和SP共染，而與IB4幾乎無共染［13-14，25］。與該結(jié)果類似，我們亦觀察到HCN2主要與CGRP共染，與IB4無共染，同時我們首次發(fā)現(xiàn)HCN4與IB4存在共定位，揭示了HCN通道各亞型在傷害性初級傳入神經(jīng)末梢中有其獨特的表達(dá)模式，其中HCN2和HCN4是分布在傷害性初級傳入末梢的主要類型。本課題組在近年的一項研究中已證實HCN1～4亞型在興奮性突觸末端有表達(dá)，且以HCN4為主［8］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HCN1～4與VGAT均有共定位，HCN4的共定位明顯高于其他亞型。以上結(jié)果提示，在結(jié)構(gòu)功能和表達(dá)上，HCN4與中間神經(jīng)元軸突末梢存在緊密且復(fù)雜的聯(lián)系。樹突和軸突是神經(jīng)元接收和傳出信息的兩個主要結(jié)構(gòu)，Jiang等［26］檢測到慢性壓迫模型誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性痛模型大鼠中，受損坐骨神經(jīng)的HCN1和HCN2顯著增加，表明周圍神經(jīng)的軸突上存在HCN表達(dá)。本研究首次發(fā)現(xiàn)背角淺層的HCN1和HCN4與樹突標(biāo)志物少量共染，與軸突標(biāo)志物幾乎不共染，可能與背角Ⅱ?qū)拥慕馄蕵?gòu)成有關(guān)，即脊髓薄片的Ⅱ?qū)釉诠鈱W(xué)顯微鏡下表現(xiàn)為半透明狀，主要原因是此層的軸突較少。在SMI-312表達(dá)稍多的Ⅲ層，HCN1和HCN4均與其存在不同程度的共染。以上結(jié)果表明HCN1和HCN4在背角淺層神經(jīng)元接收信息的過程中發(fā)揮一定的作用。

表2 HCN1～4與免疫標(biāo)志物共染部分占免疫標(biāo)志物的百分比Table 2.Percentage of marker-IRprofiles immunoreactive for HCN1～4（%.Mean±SEM）

表3 HCN1～4與免疫標(biāo)志物共染部分占HCN1～4的百分比Table 3.Percentage of HCN1～4-IRprofiles immunoreactive for the markers（%.Mean±SEM）

綜上所述，本研究揭示了HCN通道各亞型在大鼠脊髓背角細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的定位特點，為闡明HCN通道在脊髓水平的生理和病理作用提供了參考資料，有助于深入研究HCN通道在脊髓背角的調(diào)控機制。