楊力，楊志亮，賈桂云

（海南師范大學化學與化工學院，海南?？?71158）

夏枯草（Prunella vulgaris L.）為唇形科植物，其藥用部位為干燥果穗.主產(chǎn)于江蘇、河南、湖北、湖南等地.藥性為辛、苦，寒.歸膽、肝經(jīng)具有清熱瀉火、散結、清肝、明目、止痛、消腫功效.用于治療羞明流淚、目赤腫痛、乳癰腫痛、頭痛眩暈、瘰疬、利尿、癭瘤.現(xiàn)代臨床多用于治療甲狀腺腫大、淋巴結核、乳腺增生、高血壓、肺結核、急性黃疸型傳染性肝炎等疾病[1-2].

夏枯草含有三萜皂苷、金絲桃苷、甾醇、蕓香苷等苷類物質及黃酮類、咖啡酸、香豆素、有機酸、生物堿、揮發(fā)油及糖類等多種生物活性物質[3-6].文章研究夏枯草不同溶劑的提取物抑菌性能，為夏枯草的開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療機械廠）；LRH-150-MS霉菌培養(yǎng)箱（韶關市宏泰醫(yī)療機械有限公司）；VS-1300新穎型100級凈化工作臺（鴻基潔凈科技有限公司）；ZN-04小型粉碎機（北京興時利和科技發(fā)展有限公司廠）；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；FA1604電子天平（上海精科天平）；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）.

1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂（廣東環(huán)凱微生物科學有限公司）；生理鹽水（海南東聯(lián)長福制藥有限公司）；無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、蔗糖均為國產(chǎn)分析純試劑.蒸餾水由化工學院自制.

1.3 供試材料與菌種

夏枯草干燥果穗購于海南國瑞堂中藥制藥有限公司.40℃烘干，粉碎，用石油醚在60℃水浴中加熱回流脫脂兩次，每次5 h.脫脂后抽濾，濾餅40℃烘干，備用.

大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），曲霉（Aspergillus），根霉（Rhizopus stoloni?fer），青霉（Penicillium）均由海南師范大學生命科學院微生物實驗室提供.

2 實驗方法

2.1 夏枯草不同溶劑提取物的制備

稱取脫脂后的夏枯草粉末4份，每份10 g，分別用水、無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯提取，料液均比1∶16，回流提取5 h.提取液減壓濃縮.無水乙醇提取物濃縮后的浸膏用蒸餾水定容，其它三種提取物濃縮液分別用相應的溶劑定容至100 mL，得到相當于生藥濃度為100 mg/mL的4種提取物.

2.2 培養(yǎng)基的制備

按照文獻[7]，細菌培養(yǎng)基用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方制備；霉菌培養(yǎng)基用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方制備.

2.3 菌懸液的制備

從4℃冰箱中取出供試菌，在凈化工作臺上，用畫線法接種在新鮮斜面培養(yǎng)基上，細菌經(jīng)37℃，24 h，霉菌經(jīng)28℃，48 h恒溫培養(yǎng)，菌種即被活化.

用無菌生理鹽水洗下斜面培養(yǎng)基的細菌，吸取1.00 mL菌原液加入9.00 mL無菌生理鹽水中，得稀釋10倍的菌懸液，依次進行梯度稀釋.吸取不同稀釋度的菌懸液0.20 mL，分別加入到已滅菌冷卻的各自適宜的平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻.按細菌經(jīng)37℃，24 h、霉菌經(jīng)28℃，48 h恒溫培養(yǎng).根據(jù)觀察結果，選取各自適宜的菌液濃度，要求在該濃度下，菌能長滿整個培養(yǎng)皿且分布均勻.

2.4 濾紙片的制備

將直徑13.00 mm濾紙片，放入潔凈的試管內(nèi)，經(jīng)0.1MPa，121℃滅菌20 min，備用.

2.5 提取物的抑菌活性測定

按照文獻[8]采用紙片擴散法進行抑菌試驗.用無菌鑷子取滅菌后的濾紙片，浸泡在提取物中，空白試驗用濾紙片浸泡在隨行的溶劑中，浸泡時間均為30 min，瀝干備用.

在無菌培養(yǎng)皿中倒入約15 mL已滅菌的培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用無菌移液管吸取各自適宜濃度的菌懸液0.2 mL滴加在平板培養(yǎng)基表面，用無菌涂布器將菌懸液涂抹均勻.用無菌鑷子夾取藥敏濾紙片，均勻地貼在含菌培養(yǎng)基表面，每皿3片，同時放1片空白對照，每種提取物做3次重復.細菌37℃，24 h，霉菌28℃，48 h恒溫培養(yǎng)后，測量其抑菌圈直徑，比較抑菌效果.

2.6 不同濃度提取物抑菌效果

用2倍稀釋法，將夏枯草乙酸乙酯提取物（濃度100 mg/mL）稀釋為1/2、1/4、1/8、1/16，得到濃度50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.3 mg/mL提取物，按照2.5項下的方法進行抑菌活性測定.

2.7 最小抑菌濃度（MIC）的測定

按照文獻[8]采用試管稀釋法，對乙酸乙酯提取物進行稀釋，得到系列濃度待試樣品，吸取各濃度樣品2 mL注入滅菌培養(yǎng)皿中，每皿加無菌培養(yǎng)基18 mL，制成含各濃度提取物的供試平板.待培養(yǎng)基冷卻凝固后加入0.2 mL菌懸液用無菌涂布器涂抹均勻，細菌37℃，24 h、霉菌28℃，48 h培養(yǎng)后觀察.每個濃度做3個重復，并放置1片做空白對照.以不長菌的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）.

3 結果與分析

3.1 不同溶劑提取物抑菌實驗結果

采用紙片擴散法對夏枯草的無水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物進行抑菌試驗，結果見表1.

表1 不同溶劑提取物抑菌效果Tab.1 Antimicrobial effects of different solvent extracts

實驗顯示，夏枯草的無水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、曲霉、根霉都有抑菌效果，對青霉沒有形成抑菌圈.表明夏枯草的無水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物對青霉沒有抑菌效果；水提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有抑菌效果，對曲霉、根霉、青霉沒有形成抑菌圈，表明夏枯草的水提物對霉菌沒有抑菌效果.

乙酸乙酯、正丁醇提取物抑菌效果好于其他溶劑的提取物.因此，選用乙酸乙酯提取物做進一步的抑菌試驗.

3.2 不同濃度乙酸乙酯提取物的抑菌效果

不同濃度夏枯草乙酸乙酯提取物對供試菌的抑菌效果見表2.

表2 不同濃度提取物的抑菌效果Tab.2 Antimicrobial effects of different concentration extracts

實驗顯示，隨著乙酸乙酯提取物濃度的降低抑菌圈直徑變小，說明抑菌效果隨著提取物濃度的降低而降低.乙酸乙酯提取物對5種供試菌抑菌大小順序為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞根霉＞曲霉.

3.3 乙酸乙酯提取物最小抑菌濃度（MIC）

采用試管稀釋法，對乙酸乙酯提取物（濃度100mg/mL）進行2倍稀釋，得到系列濃度待試樣品，最小抑菌濃度試驗結果見表3.

表3 乙酸乙酯提取物的最小抑菌濃度Tab.3 MIC by extract of acetic ether

表3顯示，夏枯草乙酸乙酯提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度均為2.5 mg/mL；對大腸桿菌、根霉的最小抑菌濃度為5 mg/mL；對曲霉的最小抑菌濃度為10 mg/mL.

4 結論

夏枯草的乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、曲霉、根霉均有抑菌效果，且最小抑菌濃度≤10mg/mL.表明它是一種有開發(fā)潛力的抑菌物質.

我國夏枯草資源豐富，夏枯草的有效抑菌成分提取工藝簡單，因此，夏枯草在食品防腐和水果保鮮等領域具有廣闊的應用前景.枯草抑菌有效成分的鑒定、分離和抑菌機理等有待于進一步的研究.

[1] 高學敏.中藥學[M].北京:中國中藥學出版社,2007:91-93.

[2] 劉悅,宋少江,徐綏緒.夏枯草的化學成分及生物活性研究進展[J].沈陽藥科大學學報,2003,20(1):55-59.

[3] 孟正木,何立文.夏枯草化學成分研究[J].中國藥科大學學報,1995,26(6):329-331.

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[5] 周菁齊,徐仲仙,徐聲林,等.近年夏枯草化學成分和生物活性研究概況[J].中成藥,1996(12):40-45.

[6] 孫維廣,廖慧麗,葉志明,等.夏枯草化學及藥理研究概況[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2003,10(8):86-88.

[7] 沈萍,范秀容,李廣武,等.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,1996:49-57.

[8] 管遠志,王艾琳,李堅,等.醫(yī)學微生物學實驗技術[M].北京:化學工業(yè)出版社,2006:108-147.