高玉龍，肖炳光，Ralph E Dewey

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，云南省玉溪市南祥路14號 653100;

2 北卡州立大學 Raleigh, NC 27695-7620

植物開花是一個復雜過程，受外部環(huán)境因素和內(nèi)部基因表達的影響調(diào)控。擬南芥的開花受光周期、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑控制[1]，光周期途徑信號經(jīng)CO(CONSTANCE)傳遞給FT（Flowering Locus T），春化途徑和自主途徑信號經(jīng)FLC（Flowering Locus C）傳遞給FT，F(xiàn)T基因的表達誘導花分生組織特異基因AP1(APETALA1)的表達，從而誘導開花?？梢?，F(xiàn)T基因是控制植物開花信號的匯集點。從對擬南芥FT基因的研究來看，F(xiàn)T編碼的蛋白可能是植物“開花素”的重要組成部分[2-4]。FT基因在誘導植物早花的基因工程研究中應用也最為廣泛和有效。

FT基因編碼的蛋白質(zhì)屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（Phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP）家族，不同作物的FT基因高度保守。通過異位表達擬南芥FT基因，能夠誘導番茄[5]、矮牽牛[6]、瓜類蔬菜[7]等提前開花。

利用FT基因誘導早花在煙草中也已有報道，Ramsey等[8]將擬南芥FT基因?qū)氚桌邿烼N90中組成型表達，轉(zhuǎn)基因植株播種后40天左右開花，而正常的非轉(zhuǎn)基因植株要145天左右開花。Ramsey提出將轉(zhuǎn)FT基因應用于煙草回交育種，與常規(guī)回交選育相比，育成新品種的時間可以縮短將近一半，利用病毒表達載體使FT基因在煙草中瞬時表達，能夠誘導短日照馬里蘭煙在長日照條件下開花[9-10]。

我國煙草育種工作雖然取得了明顯的成績，但目前生產(chǎn)上的主栽品種比較單一，急需加大煙草品種選育的力度和進度，而煙草生育期比較長，是限制煙草育種進程的一個主要因素。PVX表達系統(tǒng)能夠快速表達外源基因，而且不涉及轉(zhuǎn)基因。本研究利用PVX瞬時表達技術(shù)使擬南芥FT基因在烤煙、香料煙、白肋煙中瞬時表達，建立誘導煙草早花的PVX-FT系統(tǒng)，以期為加快煙草育種進程提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙品種K326，云煙87，紅花大金元；白肋煙品種TN90；香料煙TEVB(轉(zhuǎn)基因Xanthi，將TEV的HC-Pro基因?qū)隭anthi，使PVX病毒更容易侵染)。

限制性內(nèi)切酶購于NEB，T4 DNA連接酶購于大連寶生物。根癌農(nóng)桿菌GV3101，PVX-FT病毒表達載體由北卡州里大學Ralph Dewey教授惠贈。

1.2 農(nóng)桿菌滲濾

將構(gòu)建的載體pCAM:pGR106-FT和空載體pCAM:pGR106質(zhì)粒DNA通過凍融法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌種GV3101。選取4片真葉左右煙苗的底部2片真葉滲濾法分別接種，利用3mL注射器吸取滲濾液，注射器對著葉片背面輕輕擠壓，直到整個葉面濕潤。具體步驟參考Van der Hoorn等[11]。

1.3 煙苗生長條件及調(diào)查標準

煙苗種植于光照培養(yǎng)室，光照12 h白天，黑夜12 h。溫度設定為白天26℃，黑夜18℃。PVX癥狀出現(xiàn)時間、現(xiàn)蕾和開花時間分別以50%試驗苗出現(xiàn)PVX癥狀、現(xiàn)蕾和開花的時間表示。

1.4 FT基因表達分析

取滲濾后不同時間段有PVX病毒癥狀的煙株葉片，用Trizol（Invitrogen）提取RNA，SuperScript II RT（Invitogen）合成cDNA。對FT基因的表達進行半定量PCR（RT-PCR）分析。

2 結(jié)果

2.1 PVX-FT系統(tǒng)在不同煙草類型中的效果

PVX-FT系統(tǒng)能夠誘導供試烤煙、香料煙、白肋煙品種早花。PVX病毒癥狀在接菌后7～14天出現(xiàn)，質(zhì)粒pCAM:pGR106對照要比pCAM:pGR106-FT處理提前2～3天出現(xiàn)PVX癥狀。接菌后23～35天pCAM:pGR106-FT處理處于現(xiàn)蕾期，接菌后39～50天pCAM:pGR106-FT處理開花（表1）。質(zhì)粒對照和buffer對照在pCAM:pGR106-FT處理開花時仍然處于營養(yǎng)生長階段（圖1）。

表1 參試品種各階段的觀察記載

圖1 PVX-FT系統(tǒng)誘導不同類型煙草早花

2.2 PVX-FT系統(tǒng)滲濾后FT基因的表達分析

為了研究滲濾后FT基因在煙株中的表達情況，我們提取了接菌后4天，8天，12天，現(xiàn)蕾階段，開花階段葉片的RNA，進行FT基因的RT-PCR。在試驗中，我們發(fā)現(xiàn)同一批滲濾煙株（TEVB），少量植株接菌后表現(xiàn)病毒癥狀，但不早花。提取這些植株的兩個時間段（與表現(xiàn)早花植株現(xiàn)蕾和開花同時間）葉片RNA，進行RT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)不早花的植株，F(xiàn)T基因不表達。早花植株在接菌后4天到開花期都能檢測到FT基因的表達（圖2）。

圖2 滲濾后TEVB葉片中FT基因的RT-PCR分析

3 討論

馬鈴薯X病毒作為瞬時表達載體具有宿主范圍廣泛、轉(zhuǎn)化方法簡單、可快速得到高拷貝的外源基因、目的基因不需穩(wěn)定整合到宿主基因組中就可以系統(tǒng)侵染植株等優(yōu)點，而且其不能通過昆蟲介體傳播，因而成為理想的植物病毒表達載體之一。1992年Chapman等[12]成功構(gòu)建PVX表達載體，目前，已被廣泛應用于研究病毒的侵染、移動、病毒蛋白的功能及生產(chǎn)外源蛋白[13-14]等方面。但是，PVX表達載體也有一些缺陷。如其對外源基因大小有一定的限制，PVX載體對于超過2kb的基因很難表達或不表達；PVX載體經(jīng)多代繁殖后外源基因容易丟失等。

植物每個調(diào)控途徑有一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，涉及多個基因。由于FT基因參與了多個開花調(diào)控途徑，并且其位于開花通道下游，所以FT基因被廣泛應用于誘導植物早花研究。利用蘋果潛隱球形病毒（ALSV）在大豆中使擬南芥FT基因瞬時表達，F(xiàn)TALSV能使短日照大豆在長日照條件下，在第四到第七節(jié)（侵染后40天左右）期開花，而對照要到20節(jié)以上才開花[15]。不僅如此，F(xiàn)T基因還能誘導多年生的蘋果樹早花，利用ALSV載體使擬南芥FT基因在蘋果樹中瞬時表達，在侵染后45到60天，蘋果樹就能開花，大大縮短了蘋果育種中每代需要的時間[16]。Li等[9]利用PVX載體在馬里蘭煙中瞬時表達FT，誘導短日照習性的馬里蘭煙在長日照條件下早花。本研究利用PVX病毒載體將擬南芥FT基因在不同類型煙草中進行瞬時表達，結(jié)果表明PVX-FT系統(tǒng)能夠誘導烤煙、白肋煙和香料煙早花?？梢奝VX-FT系統(tǒng)可以誘導不同類型煙草早花。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)PVX-FT處理一批苗時會有個別煙株不表現(xiàn)早花的現(xiàn)象，這種煙株中檢測不到FT基因表達，這種現(xiàn)象可能是由于PVX-FT載體在繁殖過程中FT基因丟失造成的。本研究構(gòu)建的PVX-FT系統(tǒng)，可明顯縮短煙草每世代所需的時間，應用于煙草常規(guī)育種后將大大縮短育成新品種所需的時間。由于PVX-FT侵染煙草后會植株會表現(xiàn)PVX癥狀，所以該技術(shù)適用于不對性狀進行選擇的情況下，如育種加代或利用與某個性狀緊密連鎖的分子標記對性狀進行選擇時。

4 結(jié)論

利用PVX病毒瞬時表達載體使擬南芥FT基因在煙草中瞬時表達，該技術(shù)能夠誘導烤煙、白肋煙和香料煙早花。將該技術(shù)應用于煙草育種，可以縮短每個世代所需的時間，從而加快育成新品種的時間。

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