張建平，黃朝章，鄧其馨，蘇明亮，謝衛(wèi)，許寒春，劉澤春，吳清輝

福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建省廈門市海滄區(qū)新陽工業(yè)區(qū)新景路1號 361022

硝酸鹽和亞硝酸鹽是煙草中一類重要的含氮化合物，其含量的多少不但直接影響煙葉的吃味和品質(zhì)[1]，還會影響其他含氮化合物的形成和含量。其中，亞硝酸鹽更是煙草特有亞硝胺的直接前體物，它的含量與煙草特有亞硝胺的含量顯著相關(guān)[2]。隨著人們對煙草特有亞硝胺的日益關(guān)注，如何快速準(zhǔn)確地對硝酸鹽和亞硝酸鹽進(jìn)行定量分析也顯得愈發(fā)重要。

然而，目前煙草行業(yè)仍缺乏一套能同時測定煙草中硝酸鹽與亞硝酸鹽的方法，相關(guān)的僅有YC/T 296-2009 煙草及煙草制品硝酸鹽的測定-連續(xù)流動法[3]，其測定的是氮氧化物的總量，因此急需摸索并建立相應(yīng)的檢測方法，以保證煙草安全性評價及減害工作的順利進(jìn)行。目前，國內(nèi)外用于測定硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法主要集中于水體、食品、蔬菜等領(lǐng)域，根據(jù)其測定原理的不同，主要分為光譜法[4-7]、色譜法[8-10]、電化學(xué)法[11-15]等三大類。離子色譜法具有樣品前處理簡單、檢測靈敏度高、儀器操作方便等優(yōu)點，已成為國內(nèi)外眾多標(biāo)準(zhǔn)中亞硝酸鹽與硝酸鹽檢測的經(jīng)典方法。因此，本文嘗試采用離子色譜，優(yōu)化相關(guān)條件，建立一種能夠同時測定煙草及煙草制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法。

l 實驗部分

1.1 儀器與試劑

戴安ICS-300離子色譜儀，配AS-4mm電導(dǎo)檢測器，ASRS300-4mm陰離子抑制器，IonPac AS11-HG色譜柱4 mm ×250 mm(帶AS11-HG保護柱4 mm×50 mm)，KOH洗脫液發(fā)生器；4.5μm微孔過濾膜；SH300超聲波發(fā)生器（超聲頻率40 KHz，美國Elmasonic公司）；BSA2245-CW電子天平（感量：0.0001 g，德國Sartorius公司）。

硝酸鈉、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%，購于美國Accustandard）；水，符合GB/T6682中一級水的要求；實驗用煙樣均由福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

準(zhǔn)確稱取0.06 g（精確至0.1 mg）亞硝酸鈉、1.37 g（精確至0.1 mg）硝酸鈉用水溶解，定容為1000 mL，即配制成NO2-、NO3

-濃度分別為40 mg/L、1000 mg/L的儲備液。根據(jù)需要配成如下濃度范圍的工作溶液：c(NO2-)：0.032、0.040、0.100、0.200、0.400、0.800、1.600 mg/L； c(NO3-)：0.800、1.000、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 mg/L。

1.3 樣品前處理

將煙葉或煙絲放人烘箱中，40 ℃下烘干，研磨，過2 mm篩，得到的煙草粉末立即裝入潔凈干燥的廣口瓶中，密封保存待測。

稱取0.5 g（精確到0.1 mg）待測樣品于250 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL水，具塞后置于超聲波發(fā)生器超聲處理60 min。靜置后，取上層清液經(jīng)0.45μm水相濾膜過濾后待測。

1.4 儀器條件

流動相：水；流速1.2 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量25 μL；KOH梯度洗脫程序見表1，抑制器電流179mA，以AS-4mm電導(dǎo)檢測器作為檢測器。

1.5 定性定量方法

按照1.4儀器測試條件測定1.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和1.3試樣萃取液，依保留時間定性，外標(biāo)法定量。試樣中NO2-、NO3-的含量（X）由式（1）計算得出，結(jié)果以mg/kg表示：

式中：

X ——試樣中NO2-、NO3-的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

k ——稀釋倍數(shù)；

c ——由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得出的NO2-、NO3-濃度，單位為毫克每升（mg/L）；

c ——由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得出的空白中NO-、NO-o23濃度，單位為毫克每升（mg/L）；

V ——試樣萃取液定容體積，單位為毫升（mL）；

m ——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

W ——試樣水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 KOH梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

2.1.1 色譜柱的選擇

目前，煙草行業(yè)陰離子色譜柱配備較多的是以表面胺化的乙基乙烯基苯交聯(lián)55%的二乙烯基苯為固定相的AS11柱和AS11-HC柱。圖1為美國戴安公司使用AS11柱和AS11-HC柱分析同一樣品色譜圖，從圖中可以看出，AS11-HC柱分離亞硝酸和硝酸效果要比AS11柱好。這可能是因為AS11-HC柱的基質(zhì)微粒是直徑為9 μm的大孔樹脂，而AS11柱的基質(zhì)微粒是直徑為13 μm的微孔樹脂，AS11-HC柱的柱效和柱容量都比AS11高。因此，本實驗選用IonPac AS11-HC（4 mm×250 mm）陰離子交換柱來作為分析柱。

圖1 IonPac AS11柱與AS11-HC分離同一樣品的色譜對比圖

2.1.2 洗脫液的選擇

由于碳酸氫根洗脫液（碳酸根-碳酸氫根混合物）抑制后形成的碳酸易于部分電離，從而導(dǎo)致背景電導(dǎo)和基線噪聲都比希望的高[16]，因此選擇氫氧根洗脫溶液作為洗脫液。

在1 mL/min的流速下，比較了5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L KOH 濃度下的 CH3COO-、HCOO-、F-、Cl-、NO2-、CO32-、NO3-、SO42-混合標(biāo)樣色譜分離的情況。如圖3所示，當(dāng)KOH溶液濃度小于或等于 15 mmol/L時， NO2-、NO3-與周邊離子達(dá)到較好的基線分離。

圖2 各等度洗脫條件下0.5mg/L CH3COO-、HCOO-、F-、Cl-、NO2-、CO32-、NO3-、SO42-混合標(biāo)樣的色譜圖

由于在實際樣品中可能存在其它未知離子對目標(biāo)峰的干擾，通過文獻(xiàn)調(diào)研[17]和樣品普查，實驗最終采用了表1的梯度洗脫程序：開始0到20分鐘采用低濃度KOH溶液洗脫液，以保證NO2-和NO3-的分離不受其它離子峰的干擾；而后提高KOH溶液濃度到60 mmol/L，加快洗脫CO32-、SO42-等多價離子及一些難洗脫的離子以避免對柱的污染；而后降低KOH溶液濃度，使柱子平衡，為下一個樣品做準(zhǔn)備；整個梯度過程僅需28分鐘。

在這一梯度洗脫條件下，標(biāo)樣及樣品分離結(jié)果如圖3、4所示。

圖3 梯度條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖4 梯度條件下樣品萃取液色譜圖

由標(biāo)樣及樣品的色譜圖可以看出，在此梯度條件下待測離子得到很好的分離。

2.2 樣品前處理

為了兼顧樣品的類型和濃度范圍，實驗選取了樣品1（烤煙）、樣品2（香料煙）、樣品3（白肋煙）來做為考察對象，對樣品前處理的條件進(jìn)行摸索。

2.2.1 萃取劑的選擇

實驗考察了酸性、中性、堿性水溶液對煙草樣品中亞硝酸鹽、硝酸鹽萃取能力的影響，結(jié)果如表2、3所示：對于不同的樣品，堿性溶液與超純水提取的效果優(yōu)于酸性溶液；配對t檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：︱t NO-2︱＜2.92（查表t0.05(2)值），P＞0.05;︱t NO3-︱＜2.78（查表t0.05(2)值），P＞0.05；堿性溶液與超純水提取的效果無顯著性差異。以上結(jié)果與庹蘇行[18]、楊蕾等[19]報道的結(jié)果相一致?？紤]到堿性萃取劑可能對基線造成干擾，本實驗采用超純水作為萃取劑。

表2 不同萃取劑對NO2-萃取能力的比較 (mg/kg，n=5)

表3 不同萃取劑對NO3-萃取能力的比較 (mg/kg，n=5)

2.2.2 萃取方式的選擇

對超聲和振蕩兩種萃取方式進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示：在考察范圍內(nèi)，振蕩萃取的效果要比超聲萃取差，因此本實驗采用超聲萃取方式。

2.2.3 萃取劑用量的確定

為確定萃取劑的用量，實驗考察了25 mL、50 mL、75 mL、100 mL四種不同的萃取劑體積，結(jié)果如表5、6所示：在考察范圍內(nèi)，提取結(jié)果無明顯差異，但萃取體積較大時信號較小，易受基線噪音影響；而萃取體積較小時信號值背景值較大，影響測定結(jié)果。為了兼顧樣品萃取的完全和檢測的準(zhǔn)確性，萃取劑的用量采用50 mL。

表4 不同萃取方式對檢測結(jié)果的影響 (mg/kg，n=5)

表5 不同萃取體積對NO- 萃取效率的影響 (mg/kg, n=5)2

表6 不同萃取體積對NO3-萃取效率的影響 (mg/kg, n=5)

2.2.4 萃取溫度和時間的優(yōu)化

為選擇合適的萃取溫度和時間，分別在45 ℃、60 ℃、75 ℃條件下超聲萃取20 min、40 min、60 min、80 min，結(jié)果如表7所示：在考察范圍內(nèi)，溫度對萃取的效率影響不大，不做限定；萃取效率隨萃取時間增大而增大，當(dāng)萃取時間大于40 min后達(dá)到平衡?？紤]萃取的完全與樣品的差異性，同時兼顧萃取效率，選擇60 min為萃取時間。

表7 不同萃取溫度和時間對檢測結(jié)果的影響 (mg/kg, n=5)

2.3 方法驗證

2.3.1 線性關(guān)系、檢測限

將配制好的一系列亞硝酸鹽、硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.4儀器條件進(jìn)樣檢測，以相應(yīng)濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，其響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到亞硝酸鹽回歸方程為：y= 1.6752 x + 0.00113，R2=0.9997，線性范圍0.032～1.600 mg/L；硝酸鹽回歸方程為：y = 1.357x + 0.0065，R2= 0.9998，線性范圍0.800～40.000 mg/L。

取最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣10次，將10次測定的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出濃度值，再計算10次測定濃度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），分別以3SD和10SD為C代入1.5中樣品測定計算公式計算檢測限和定量限。得到該法測定亞硝酸鹽的檢測限和定量限分別為1.23 mg/kg、3.72 mg/kg，硝酸鹽的檢測限和定量限分別為1.06 mg/kg、3.16 mg/kg。

2.3.2 樣品回收率

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定方法的回收率。以已知含量的樣品為實驗本底，在本底樣品中準(zhǔn)確加入亞硝酸鹽、硝酸鹽標(biāo)樣。按照實驗方法操作，測得低、中、高3個加標(biāo)水平下的亞硝酸鹽、硝酸鹽含量值。每個水平平行測定3個樣品，取檢測值進(jìn)行加標(biāo)回收率的計算，測試結(jié)果如表8所示。結(jié)果表明本方法檢測亞硝酸鹽的回收率為96.1%～101.6%，平均回收率為97.9%；硝酸鹽的回收率為96.3%～99.0%，平均回收率為98.0%，滿足定量分析要求。

2.3.3 精密度實驗

為考察方法的精密度，對方法的日內(nèi)及日間重現(xiàn)性進(jìn)行了考察，結(jié)果如表9、10所示，日內(nèi)及日間RSD均在5%以下，方法的精密度良好。

表8 方法回收率

表9 方法檢測NO2-的日內(nèi)及日間精密度

表10 方法檢測NO3-的日內(nèi)及日間精密度

2.3.4 與經(jīng)典方法的比對

與經(jīng)典的連續(xù)流動分光光度法進(jìn)行比對，如表11所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相對平均偏差均小于5%，與經(jīng)典的連續(xù)流動分光光度法測定結(jié)果一致。

2.4 樣品測定

應(yīng)用本方法檢測了部分樣品NO2-和NO3-的含量，結(jié)果如表12所示：NO2-的含量不大，在8.45～36.30 mg/kg之間，不同類型的樣品差異較??；NO3-在不同類型的樣品中差異較大，在31.11～19151.42 mg/kg之間，含量大致規(guī)律為：白肋煙＞梗絲＞香料煙＞再造煙葉＞烤煙；混合型卷煙＞烤煙型卷煙。

表11 與分光光度法比對實驗 （mg/kg）

表12 樣品檢測數(shù)據(jù) (mg/kg)

續(xù)表12

3 小結(jié)

通過實驗，建立了煙草與煙草制品中亞硝酸鹽、硝酸鹽的離子色譜方法。采用超純水超聲提取的方法處理煙草樣品，以氫氧化鉀溶液為洗脫液、陰離子交換柱分離、電導(dǎo)檢測器檢測。該方法作為煙草與煙草制品中硝酸鹽與亞硝酸鹽的測定方法，操作簡便、準(zhǔn)確、快捷，選擇性好，具有較強的實用價值。

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