張曉玲，胡蕓文，周志統(tǒng)

上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

人腸道病毒(human enterovirus，HEV)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)中腸道病毒屬。病毒為單股正鏈RNA，大小約7.5 kb。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白為VP1～4，VP1～3位于病毒表面，其抗原決定簇決定腸道病毒血清型，而VP4在病毒內(nèi)部。

HEV主要通過(guò)糞-口途徑傳播，少數(shù)也經(jīng)呼吸道傳播，可引起多種不同臨床表現(xiàn)的疾病，包括發(fā)熱、腹瀉、出疹、無(wú)菌性腦膜炎、腦膜腦炎、心肌炎、肺水腫和急性弛緩性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)等[1]。近年來(lái)，一些研究表明HEV還與慢性病如1型糖尿病[2,3]等相關(guān)。

1 HEV的分型方法

1.1 傳統(tǒng)分型法

傳統(tǒng)的HEV分型主要基于病毒分離和抗血清中和試驗(yàn)?？滤_奇病毒 (coxsackievirus, CV)的分離是將呼吸道和糞便標(biāo)本等接種于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，待產(chǎn)生細(xì)胞病變后，通過(guò)抗血清中和試驗(yàn)進(jìn)行血清型定型[4]。這種方法將HEV分為64種血清型，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus,PV)1～3，柯薩奇病毒A組(coxsackievirus A,CVA)1～22、CAV24和柯薩奇病毒B組(coxsackievirus B,CVB)1～6，?？刹《?echovirus,ECV)1～7、ECV9、ECV11～21、ECV24～27、ECV29～33和HEV68～71。

1.2 基因分型法

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于病毒核苷酸序列分析的分型方法越來(lái)越多地被應(yīng)用。這種方法是根據(jù)病毒的分子特點(diǎn)進(jìn)行分型。1970年國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)將脊髓灰質(zhì)炎病毒﹑柯薩奇病毒和埃可病毒之后被發(fā)現(xiàn)的HEV按序號(hào)命名。參考ICTV小RNA病毒組的最新數(shù)據(jù)，2000年至今已發(fā)現(xiàn)40余種新型HEV，最新序號(hào)到了HEV-A119 (http://www.picornastudygroup.com/types/enterovirus/ev_types.htm)。

1.2.1基于VP1序列分析定型1999年，Oberste等[5]對(duì)HEV VP1區(qū)核酸序列進(jìn)行研究，建立了根據(jù)VP1基因序列分析來(lái)鑒定HEV型別的方法。他們通過(guò)對(duì)47株HEV血清型原型株和10株抗原變異株的VP1全長(zhǎng)序列測(cè)序，聯(lián)合GenBank中可利用的序列，構(gòu)成了一個(gè)包含66種HEV原血清型和另外7種血清型的VP1序列數(shù)據(jù)庫(kù)，用這些VP1序列建立的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，將HEV分為A～D組。另外，根據(jù)被鑒定的核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有HEV血清型參考株的核苷酸序列比對(duì)的結(jié)果，制訂了如下分型規(guī)則：如被鑒定的毒株與同源性最高的參考株序列相似性>75%，且與同源性第2的參考株相似性<70%，該毒株與同源性最高的參考株為同一型；如與同源性最高的參考株序列相似性<70%，則區(qū)分為不同的HEV型別；如與同源性最高的參考株序列相似性<75%或與同源性第2的參考株相似性>70%，則有待進(jìn)一步確定。由此，原HEV22、HEV23型被獨(dú)立劃為一個(gè)新的小RNA 病毒屬：雙埃可病毒(parechovirus)，分別稱(chēng)作HPeV 1型(HEV22)和 HPeV2型(HEV23)，至今已確認(rèn)的雙?？刹《居?4種，包括HPeV1～14 (http://www.picornastudygroup.com/)。近年的研究認(rèn)為，人雙埃可病毒可能是導(dǎo)致一些嬰幼兒嚴(yán)重臨床并發(fā)癥的病原體[6,7]。

2001年，Caro等[8]設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，可擴(kuò)增腸道病毒1 452 bp的基因片段，跨越VP1的3′端、2A、2B和2C 5′端的部分區(qū)域。通過(guò)對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)產(chǎn)物測(cè)序，鑒定出64株原型株中的59個(gè)型，并對(duì)45株不同來(lái)源的分離株和6株用血清學(xué)方法未能定型的病毒株進(jìn)行了分型。根據(jù)建立的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，他們還將HEV分為5個(gè)亞組，形成了一個(gè)新的HEV分類(lèi)方法。

總之，VP1序列分析定型的特點(diǎn)是與中和試驗(yàn)結(jié)果的一致性較好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，是HEV分子分型最常用的方法。

1.2.2基于VP4序列分析定型Chu等[9]對(duì)1998年臺(tái)灣暴發(fā)的手足口病做流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，采用VP4全長(zhǎng)序列建立了HEV的定型分析方法，其結(jié)果與基于VP1序列的定型方法有較高的符合率。2002年Kubo等[10]對(duì)6份手足口病伴無(wú)菌性腦炎的病例標(biāo)本嘗試HEV分型，也采用了對(duì)VP4序列分析的方法，結(jié)果與血清學(xué)檢測(cè)方法一致。

VP4全長(zhǎng)序列僅有207個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)，比VP1基因序列(834 ～ 951 nt)短得多，因而基于VP4序列的分型方法更便捷和快速。另外，由于VP4處在病毒內(nèi)部，基因序列較為穩(wěn)定，所以可能更適用于HEV的分型。

1.2.3基于多段序列分析定型HEV的不同基因區(qū)域存在不同突變率，而HEV不同型別之間也可能發(fā)生重組[11-13]。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了HEV不同型別間存在的重組現(xiàn)象，如Smura等[14]從AFP病例和健康個(gè)體的腸道株中發(fā)現(xiàn)EV96株其實(shí)是HEV C組與脊髓灰質(zhì)炎病毒的重組產(chǎn)物；Yozwiak等[15]的研究顯示，HEV109是HEV A組與C組的重組產(chǎn)物。因此，基于HEV的單一區(qū)域進(jìn)行序列分析而定型的方法并非完全可靠。

為了更準(zhǔn)確地對(duì)臨床分離的HEV株進(jìn)行分型，Manzara等[16]采用了多片段序列分析定型的方法。除VP1、VP4-VP2序列分析外，他們還加入了5′非編碼區(qū)序列進(jìn)行分析，將3段區(qū)域序列分析的方法聯(lián)合使用，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)其收集的所有HEV標(biāo)本的分子分型。此外，要得到精確、可信的分型結(jié)果，還需對(duì)HEV的每一段序列分析建立嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。

2 HEV型別的鑒定

2.1 病毒分離和抗血清中和試驗(yàn)

從臨床獲得的不同類(lèi)型標(biāo)本，如鼻咽拭子、糞便、皰疹液、腦脊液等，經(jīng)處理后接種到細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離和培養(yǎng)。常用的細(xì)胞系包括人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(CaCo-2)、人肺癌細(xì)胞(A549)、人喉癌細(xì)胞(Hep-2C)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人胎成纖維細(xì)胞(HFF)、綠猴腎細(xì)胞系(GMK、Vero、LLC)、小鼠轉(zhuǎn)人脊髓灰質(zhì)炎受體細(xì)胞(L20B)[17]、小鼠轉(zhuǎn)CVB受體細(xì)胞(L-hCAR)[18]等。產(chǎn)生細(xì)胞病變后，用組合血清初步定型，再用特異的單型抗血清證實(shí)。目前常用的LBM組合血清(A～H)可鑒別42個(gè)型的HEV(包括ECV22、ECV23)。如果未鑒定成功，可再用含19個(gè)型的CVA抗體組合(J～P)進(jìn)行鑒定[19]。另一種組合血清是目前世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦各國(guó)脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的RIVM，在LMB組合血清的基礎(chǔ)上還增加了對(duì)HEV68～71 型鑒定[20]。國(guó)內(nèi)有中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所配制的KMB組合血清，能鑒定CVA9、CVB、ECV等共28個(gè)血清型。

上述傳統(tǒng)分型方法一直是業(yè)內(nèi)“金標(biāo)準(zhǔn)”，但存在很多限制。如細(xì)胞培養(yǎng)方面的問(wèn)題包括：①獲得多種對(duì)HEV敏感的細(xì)胞系較困難；②維持多種細(xì)胞系生長(zhǎng)費(fèi)用較高；③同時(shí)采用多種細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離，雖可提高病毒分離率，但工作量大大增加；④一些新發(fā)現(xiàn)的病毒不能體外培養(yǎng)，如HEV104[21]，部分CVA只能用接種乳鼠的方法進(jìn)行分離；⑤細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，判斷病變存在主觀因素，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)、耗力。組合血清鑒定方面的問(wèn)題包括：①HEV血清型繁多，目前可供鑒定使用的抗血清(RIVM、LBM和KMB)尚不足以覆蓋全部HEV型別，當(dāng)抗原變異、出現(xiàn)新的病毒或標(biāo)本中有多種病毒時(shí)，就可能無(wú)法鑒定；②某些型別之間有共同抗原而存在交叉反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不可靠[22,23]。

2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)聯(lián)合序列測(cè)定是目前用于HEV基因分型的常用技術(shù)。2003年，Bourlet等[24]采用梯度PCR，區(qū)分全部64種不同血清型的HEV。Oberste等[25]針對(duì)3′非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了種特異性RT-PCR引物，可實(shí)現(xiàn)HEV A～D組的快速篩查。隨后又進(jìn)一步設(shè)計(jì)了半套式PCR(semi-nested PCR,snPCR)[26]，可對(duì)64種原血清型和22種新血清型的HEV進(jìn)行分型。

與傳統(tǒng)病毒分離和抗血清中和分型方法相比，PCR簡(jiǎn)便、快速、費(fèi)用低，適合臨床診斷。將PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床HEV標(biāo)本進(jìn)行高靈敏度、高特異度分型。但RT-PCR方法易引起實(shí)驗(yàn)室污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施條件和操作人員技術(shù)有較高要求。

2.3 核酸雜交和自動(dòng)化測(cè)序

2.3.1核酸雜交根據(jù)HEV不同血清型在基因序列上存在高度保守區(qū)的特點(diǎn)，20世紀(jì)90年代初Rotbart等[27]使用cDNA探針檢測(cè)多種HEV。這種雜交方法與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法相比，對(duì)腦脊液標(biāo)本檢測(cè)的靈敏度和特異度都較差，對(duì)糞便標(biāo)本檢測(cè)的靈敏度也不高。

相比cDNA探針，RNA探針有更高的親和性，且無(wú)載體序列干擾，避免了非特異性雜交。Rotbart等[28]將3種RNA探針聯(lián)合使用，可檢測(cè)16種HEV，而Cova等[29]設(shè)計(jì)的單RNA探針可檢測(cè)12種HEV血清型。盡管RNA探針與cDNA探針相比，其檢測(cè)靈敏度有所提高，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到臨床診斷的要求[30]。

2.3.2自動(dòng)化測(cè)序桑格雙脫氧核苷酸終止法測(cè)序是過(guò)去測(cè)序的主導(dǎo)方法，但因費(fèi)用高、時(shí)間限制等原因，無(wú)法普遍應(yīng)用。新一代的焦磷酸測(cè)序技術(shù)開(kāi)創(chuàng)了基因序列測(cè)序的新紀(jì)元，引發(fā)了高通量數(shù)據(jù)分析的熱潮，為臨床研究和診斷應(yīng)用展現(xiàn)了新的前景[31]。代表的商業(yè)公司有Roche/454 Life Sciences Ion Torrent、Illumina/Solexa、Applied Biosystems Solid等，以及產(chǎn)品正在開(kāi)發(fā)中的VisiGen和Pacific Biosciences[32]。新型HEV109就借助了新一代測(cè)序技術(shù)，從尼加拉瓜流行性感冒患者的鼻咽拭子中檢測(cè)到全長(zhǎng)基因序列[15]。

總之，新一代測(cè)序技術(shù)引入了宏基因組的概念，臨床診斷實(shí)驗(yàn)室在實(shí)現(xiàn)快速篩查臨床HEV標(biāo)本或發(fā)現(xiàn)新型HEV的同時(shí)，也必將迎來(lái)新一輪挑戰(zhàn)，包括如何正確處理龐大的數(shù)據(jù)、合理解釋基因突變等問(wèn)題。

3 展望

HEV型別眾多，引起的臨床癥狀多種多樣。基于病毒核苷酸序列的基因分型方法越來(lái)越多地被應(yīng)用，為發(fā)現(xiàn)新型HEV提供了有效工具，也有利于深入研究HEV基因重組變異和毒力改變等生物學(xué)特性。盡管基因分型方法與基于病毒分離和抗血清中和試驗(yàn)的傳統(tǒng)分型方法有較高的符合率，但血清分型方法仍是經(jīng)典的HEV分型方法，基因分型方法不能完全取代。

對(duì)HEV的準(zhǔn)確分型，不僅可為臨床快速診斷和治療提供依據(jù)，還能監(jiān)測(cè)HEV的感染人群和區(qū)域，對(duì)控制疫情蔓延、開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

[1] Muir P. Enteroviruses [J].Medicine,2009,37(12):691-694.

[2] Cabrera-Rode E, Díaz-Horta O, Toniolo A, Sarmiento L. Type 1 diabetes in the tropics: A link with enterovirus infections [M/OL]. In: Diabetes and Viruses. 2013, Part 3, 195-205. http://www.springerlink.com/content/p44u882n7t068r35/.

[3] Filippi CM, Herrath MG. Viral trigger for type 1 diabetes pros and cons [J]. Diabetes, 2008,57(11): 2863-2871.

[4] Roberts JA, Kok T, Thorley B. New approaches to enterovirus identification [J/OL]. Microbiol Australia, 2010, 31(3):138-141. http://www.theasm.org.au/assets/Uploads/Sept3.pdf#page=40.

[5] Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Pallansch MA. Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification [J]. J Virol,1999,73(3):1941-1948.

[6] Alam MM, Khurshid A, Shaukat S, Sharif S, Rana MS, Angez M, Naeem M, Zaidi SSZ. Identification of human parechovirus genotype, HPeV-12, in a paralytic child with diarrhea [J]. J Clin Virol, 2012,55(4):339-342.

[7] Schuffenecker I, Javouhey E, Gillet Y, Kugener B, Billaud G, Floret D, Lina B, Morfin F. Human parechovirus infections, Lyon, France, 2008-10: evidence for severe cases [J]. J Clin Virol, 2012,54(4): 337-341.

[8] Caro V, Guillot S, Delpeyroux F, Crainic R. Molecular strategy for ‘serotyping’ of human enteroviruses [J]. J Gen Virol, 2001,82 (Pt 1): 79-91.

[9] Chu PY, Lin KH, Hwang KP, Chou LC, Wang CF, Shih SR, Wang JR, Shimada Y, Ishiko H. Molecular epidemiology of enterovirus 71 in Taiwan [J]. Arch Virol,2001,146(3): 589-600.

[10] Kubo H, Iritani N, Seto Y. Molecular classification of enteroviruses not identified by neutralization test [J]. Emerg Infect Dis,2002, 8(3): 298-304.

[11] Yip CC, Lau SK, Woo PC, Chan KH, Yuen KY. Complete genome sequence of a coxsackievirus A22 strain in Hong Kong reveals a natural intratypic recombination event [J]. J Virol,2011,85(22):12098-12099.

[12] Hu YF, Yang F, Du J, Dong J,Zhang T, Wu ZQ, Xue Y, Jin Q. Complete genome analysis of coxsackievirus A2, 4, 5, and 10 strains isolated from hand, foot, and mouth disease patients in China revealing frequent recombination of human enterovirus A [J]. J Clin Microbiol,2011,49(7):2426-2434.

[13] Han JF, Jiang T, Fan XL, Yang LM, Yu M, Cao RY, Wang JZ, Qin ED, Qin CF. Recombination of human coxsackievirus B5 in hand, foot, and mouth disease patients, China [J]. Emerg Infect Dis, 2012,18(2):351-353.

[14] Smura T, Blomqvist S, Paananen A, Vuorinen T, Sobotová Z, Bubovica V, Ivanova O, Hovi T, Roivainen M. Enterovirus surveillance reveals proposed new serotypes and provides new insight into enterovirus 5’-untranslated region evolution [J]. J GenVirol, 2007,88 (Pt 9):2520-2526.

[15] Yozwiak NL, Skewes-Cox P, Gordon A, Saborio S, Kuan G, Balmaseda A, Ganem D, Harris E,DeRisi JL. Human enterovirus 109: a novel interspecies recombinant enterovirus isolated from a case of acute pediatric respiratory illness in Nicaragua [J]. J Virol, 2010,84(18):9047-9058.

[16] Manzara S, Muscillo M, La Rosa G, Marianelli C, Cattani P, Fadda G. Molecular identification and typing of enteroviruses isolated from clinical specimens [J]. J Clin Microbiol, 2002,40(12):4554-4560.

[17] Blomqvist S, Paananen A, Savolainen-Kopra C, Hovi T, Roivainen M. Eight years of experience with molecular identification of human enteroviruses [J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(7): 2410-2413.

[18] 田炳均,徐聞,吳燕,羅梅，清水博之，吉田弘，米山徹夫，吉井久美子，和田純子，宮村達(dá)男.用L-2hCAR細(xì)胞選擇性地分離柯薩奇B組病毒[J].中國(guó)計(jì)劃免疫,2000,6(5):260-261.

[19] Melnick JL, Rennick V, Hampil B, Schmidt NJ, Ho HH. Lyophilized combination pools of enterovirus equine antisera: preparation and test procedures for the identification of field strains of 42 enteroviruses [J] . Bull World Health Organ,1973,48 (3):263-268.

[20] Melnick JL, Schmidt NJ, Hampil B, Ho HH. Lyophilized combination pools of enterovirus equine antisera: preparation and test procedures for the identification of field strains of 19 group A coxsackievirus serotypes [J]. Intervirology,1977,8(3):172-181.

[21] Kaida A, Kubo H, Sekiguchi J, Hase A, Iritani N. Enterovirus 104 infection in adult, Japan, 2011 [J]. Emerg Infect Dis, 2012,18(5): 882-883.

[22] 楊秀惠.腸道病毒診斷與分類(lèi)[J].中國(guó)計(jì)劃免疫,2006,12(3):226-229.

[23] 柯昌文.人腸道病毒分類(lèi)和鑒別方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)計(jì)劃免疫,2006,12(6):515-520.

[24] Bourlet T, Caro V, Minjolle S, Jusselin I, Pozzetto B, Crainic R, Colimon R. New PCR test that recognizes all human prototypes of enterovirus: application for clinical diagnosis [J]. J Clin Microbiol,2003, 41(4):1750-1752.

[25] Oberste MS, Maher K, Williams AJ, Dybdahl-Sissoko N, Brown BA, Gookin MS, Pearanda S, Mishrik N, Uddin M, Pallansch MA. Species-specific RT-PCR amplification of human enteroviruses: a tool for rapid species identification of uncharacterized enteroviruses [J]. J Gen Virol,2006, 87 (Pt 1):119-128.

[26] Nix WA, Oberste MS, Pallansch MA. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens [J]. J Clin Microbiol,2006,44(8):2698-2704.

[27] Rotbart HA. Nucleic acid detection systems for enteroviruses [J]. Clin Microbiol Rev,1991,4(2): 156-168.

[28] Rotbaret HA, Abzug MJ, Levin MJ. Development and application of RNA probes for the study of picornaviruses [J]. Mol Cell Probes,1988, 2(1):65-73.

[29] Cova L, kopecka H, Ayamard M, Girard M. Use of cRNA probes for the detection of enteroviruses by molecular hybridization [J]. J Med Virol, 1988, 24(1): 11-18.

[30] Petitjean J, Quibriac M, Freymuth F, Fuchs F, Laconche N, Aymardand M, Kopecka H. Specific detection of enteroviruses in clinical samples by molecular hybridization using poliovirus subgenomic riboprobes [J]. J Clin Microbiol, 1990, 28(2):307-311.

[31] Capobianchi MR, Giombini E, Rozera G. The next generation sequencing technology in clinical virology [J/OL]. Clin Microbiol Infect, 2012. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1469-0691.12056/abstract.

[32] Voelkerding KV, Dames SA, Durtschi JD. Next-generation sequencing: from basic research to diagnostics [J]. Clin Chem, 2009, 55(4):641-658.