阮力

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

痘苗病毒天壇株是中國科學(xué)家建立的一株用于預(yù)防天花的痘苗病毒，也是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)文獻記載中成功用于預(yù)防天花的疫苗毒株[1]。至1980年中國停止種痘，該疫苗在中國應(yīng)用了50余年，接種了數(shù)億人次，在消滅天花中發(fā)揮了決定性作用。痘苗病毒天壇株毒種(毒種編號：752-1)已作為中國防止天花再次出現(xiàn)的應(yīng)急儲備疫苗毒種。

痘苗病毒的宿主泛圍廣，繁殖滴度高，非必需基因多，外源基因容量大(理論上可達25～50 kb)，在胞質(zhì)復(fù)制，無致癌性，免疫力持久，有長期人體應(yīng)用歷史，這種獨特的生物學(xué)及分子生物學(xué)性狀引起了病毒學(xué)家和分子生物學(xué)家將其開發(fā)成基因工程載體的極大興趣。由于對痘苗病毒天壇株的生物學(xué)性狀和分子生物學(xué)特點研究得較清楚，它又是我國特有的預(yù)防天花的疫苗株，故應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對其改造，有可能獲得免疫效果好、不良反應(yīng)少的新一代天花疫苗株，并可能發(fā)展成為安全、高效的基因工程載體。

1982年，文獻首次報道外源基因(皰疹病毒TK基因)成功在痘苗病毒W(wǎng)R株(小鼠嗜神經(jīng)毒株)中獲得表達[2]，引起了中國科學(xué)家的極大關(guān)注。1984年，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所在朱既明院士的組織下成立了痘苗病毒基因表達載體研究協(xié)作組(以下簡稱協(xié)作組)，提出使用痘苗病毒天壇株開發(fā)可用于人體的痘苗病毒基因表達載體的新思路，從痘苗病毒天壇株的分離與檢定、基因組文庫的構(gòu)建與測序、不同類型啟動子的克隆與功能特點、不同非必需區(qū)生物學(xué)及分子生物學(xué)特性、重組病毒篩選標(biāo)記的選擇、不同類型重組載體的構(gòu)建、外源基因在重組病毒中表達、重組病毒毒力和免疫效果及小量人體免疫觀察等方面開展了全面研究。

1 痘苗病毒天壇株的挑斑純化與全基因組測序

痘苗病毒天壇株752-1毒種未經(jīng)過挑斑純化，也無詳細(xì)基因組序列研究資料。協(xié)作組從該毒種制備的疫苗(批號：7601)中挑斑克隆，篩選了一株在細(xì)胞和動物中生物學(xué)性狀與原始毒種相近的病毒，建立了該毒株HindⅢ核酸限制性內(nèi)切酶基因文庫，完成了該毒株全基因組測定[3]，為使用該毒株進行載體的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2 痘苗病毒天壇株啟動子克隆及其功能的研究

痘苗病毒天壇株啟動子克隆及其功能研究是構(gòu)建該載體系統(tǒng)的關(guān)鍵步驟。在痘苗病毒天壇株基因組內(nèi)切酶圖譜分析和基因文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)上，協(xié)作組先后克隆了4種痘苗病毒天壇株啟動子，并化學(xué)合成了一個晚期啟動子，分別為11 000蛋白(F17R)啟動子P11、7 500蛋白啟動子P7.5、25 000蛋白(F16L2)啟動子P25、147 000蛋白啟動子(PJ6R)和人工化學(xué)合成晚期啟動子PML。阿糖胞苷阻斷實驗表明，P11為晚期啟動子, P7.5為早晚期啟動子，PJ6R為早期啟動子，P25為早晚期啟動子，PML為晚期啟動子。各啟動子的活性強度為P11∶P7.5∶PJ6R∶P25∶PML≈1∶1∶0.4∶0.01∶1.2。這些啟動子的克隆為構(gòu)建不同類型的痘苗病毒天壇株表達載體提供了重要材料[4-6]。

3 痘苗病毒天壇株非必需區(qū)生物學(xué)及分子生物學(xué)特性的研究

痘苗病毒天壇株非必需區(qū)是外源基因插入表達的部位，外源基因插入后對痘苗病毒生物學(xué)性質(zhì)的影響直接關(guān)系到能否使用該非必需區(qū)進行重組病毒的構(gòu)建。另外，非必需區(qū)的基因片段又是構(gòu)建同源重組表達載體的重要組成部分。因此，非必需區(qū)生物學(xué)功能(尤其是對毒力和穩(wěn)定性影響)的研究及相應(yīng)片段的克隆就成為構(gòu)建不同類型痘苗病毒天壇株載體的另一個關(guān)鍵步驟。協(xié)作組應(yīng)用LacZ為報告基因,對痘苗病毒天壇株7個非必需區(qū)﹝HindⅢ M-SphⅠ (VS-1)、HindK-1st BglⅡ (VB-1)、HindⅢ K-3rd BglⅡ (VB-4)、HindK-4th BglⅡ (VB-6)、HindⅢ K/F-HⅢ (VH-1)、HindⅢ F-Bam (VF1GB)和HindⅢ J-TK (VJ123)﹞的生物學(xué)性狀進行了研究。發(fā)現(xiàn)有4個非必需區(qū)(VS-1、VB-4、VB-6和VH-1)對重組病毒的毒力無明顯影響，另3個(VB-1、VF1GB、VJ123)則對重組病毒的毒力有影響，其中VF1GB的影響最大。同時發(fā)現(xiàn)痘苗病毒天壇株TK區(qū)的破壞對毒力影響(1～2個對數(shù))遠較文獻中WR株(4～5個對數(shù))小。外源基因(LacZ)插入后的穩(wěn)定性研究表明，7個非必需區(qū)均能穩(wěn)定表達LacZ，從而為目的基因表達提供了良好的插入?yún)^(qū)域。另外，重組病毒在不同細(xì)胞中的復(fù)制特點及不同溫度中的穩(wěn)定性均與親本株相近[7]。

4 痘苗病毒天壇株同源重組載體的構(gòu)建

同源重組載體是獲得重組病毒的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。協(xié)作組應(yīng)用上述克隆的啟動子和非必需區(qū)的同源序列片段，構(gòu)建了2類基本載體和20余種派生載體[4-6]。 第1類載體是含有P11和P25的雙向啟動子，并能在TK區(qū)表達外源基因的pJ15和pJ120表達載體。其中，pJ15不含標(biāo)記基因，可同時表達2種外源基因，既可用于疫苗株的構(gòu)建，也可利用TK陰性標(biāo)記篩選實驗用毒株。pJ120則可利用LacZ和TK陰性雙選擇標(biāo)記迅速獲得P11啟動子表達外源基因的實驗用毒株。這2種載體的另一個創(chuàng)新點是晚期啟動子使用了啟動-終止的特殊序列，保留了P11啟動子天然轉(zhuǎn)錄起始位點，獲得了P11啟動子高啟動活性。第2類載體是應(yīng)用P7.5和P11啟動子組成的雙向表達載體pJTA1175和pJTB1175。這2種載體與第1類載體相似，但引入了強早晚期啟動子P7.5，適合依賴于早期和晚期的抗原基因表達。使用C和K的部分同源序列，并在兩片段的外測由PJ6R啟動子驅(qū)動neo基因表達，構(gòu)建成2種用于去除痘苗病毒天壇株C-K間21.3 kb基因組的“兩步同源重組”載體pCKneo和pCKneoLacZ[8-10]。這2個載體均能在重組率極低的情況下, 通過G418選擇壓力富集并獲得含neo基因的重組病毒，然后再通過撤掉G418壓力，最終獲得不含neo基因并去除了C-K片段間21.3 kb基因組的非復(fù)制型重組痘苗病毒天壇株。其中pCKneo載體構(gòu)建的重組病毒不含LacZ基因，可直接用于疫苗株研究。pCKneoLacZ載體構(gòu)建的重組病毒含有LacZ基因，結(jié)合藍白斑選擇方法也可用于非復(fù)制型重組痘苗病毒疫苗株的篩選。2個載體均有極高的篩選效率，并避免了使用雜交等繁瑣的疫苗株篩選方法。

另外，在上述載體的基礎(chǔ)上，根據(jù)外源基因表達和基因工程疫苗及多價基因工程疫苗的研究需要，派生出了20余種相應(yīng)載體，有的可用于基因表達的實驗研究，有的可用于疫苗研究，有的可用于啟動子的篩選，有的可任意操縱基因表達單元實現(xiàn)新載體的構(gòu)建。這些不同類型的載體可滿足在痘苗病毒天壇株8個不同區(qū)域進行外源基因表達的研究，為使用該毒株進行基因工程疫苗和多價基因工程疫苗的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

5 外源基因在重組痘苗病毒天壇株中的表達和重組疫苗的構(gòu)建

應(yīng)用痘苗病毒天壇株表達載體系統(tǒng)，協(xié)作組進行了20余種外源基因在痘苗病毒天壇株中單獨表達的研究，包括來自乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)，麻疹病毒(morbillivirus，MV)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)，單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV) I、II型，EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)等病毒的基因，以及白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)、IL-6、巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)等細(xì)胞因子基因的表達研究。完成了EBV+HBV、RSV+IL-2、HBV+IL-2、MV+IL-2、HAV+IL-2、HAV+IL-6、HAV+MIF及HAV+HBV+MV等多種基因同時在痘苗病毒天壇株中表達的研究。構(gòu)建了40余株重組病毒，在細(xì)胞和動物體內(nèi)對代表性毒株的生物學(xué)性狀、毒力及免疫效果進行了科學(xué)評價[11-53]。研究表明，痘苗病毒天壇株表達載體系統(tǒng)適用于外源基因表達和重組疫苗構(gòu)建研究，該載體構(gòu)建的重組疫苗在實驗動物中安全、有效。構(gòu)建的非復(fù)制型痘苗病毒天壇株表達載體解決了復(fù)制型載體的免疫效果依賴于病毒增殖的不安全性瓶頸，不但可作為安全、有效的重組載體，其本身亦可用于安全、有效的新一代天花疫苗的研發(fā)。該系統(tǒng)已提供給國內(nèi)外幾十個研究和生產(chǎn)單位，在外源基因表達、基因工程疫苗研究、單克隆抗體研制和診斷試劑開發(fā)等方面發(fā)揮了重要作用。

6 重組痘苗病毒天壇株疫苗的臨床研究

協(xié)作組成功構(gòu)建了針對HAV、HBV(帶IL-2和不帶IL-2)、MV、RSV、HSV(I、II型)及EBV等多種單價和多價重組痘苗病毒的人用疫苗株。其中針對HAV、HBV(帶IL-2和不帶IL-2)、MV及EBV的5種重組痘苗病毒天壇株活疫苗在20世紀(jì)90年代初通過衛(wèi)生部藥政局批準(zhǔn)，在國際上率先進行了小量人體免疫觀察。

1992年在美國冷泉港疫苗會議上，我國科學(xué)家首次報道了以痘苗病毒天壇株為載體的重組EBV疫苗(EBV-MA)和重組HAV疫苗(VMS11HAV25)的Ⅰ期臨床研究。TK區(qū)表達EBV-gp350 的重組痘苗病毒天壇株EBV疫苗免疫1～3歲幼兒16個月后，對照組10名全部感染EBV，而試驗組9名中僅有3名感染，且EBV抗體的效價均較低，提示重組痘苗病毒EBV疫苗可誘發(fā)一定的免疫保護[54,55]。用M片段表達HAV完整讀碼框架基因的重組痘苗病毒天壇株HBV疫苗免疫8名學(xué)齡兒童，1個月后痘苗和HAV抗體全部陽轉(zhuǎn)，并產(chǎn)生HAV中和抗體。2年后的隨訪檢測顯示，試驗組8名兒童HAV抗體仍為陽性，對照組8名兒童中有2名HAV抗體陽轉(zhuǎn)，其中1名曾出現(xiàn)甲型肝炎臨床癥狀[56,57]。上述試驗結(jié)果提示，以痘苗病毒為載體的重組疫苗可產(chǎn)生較好的免疫效果。對TK區(qū)表達HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)基因S的重組痘苗病毒天壇株HBV疫苗也進行了小量臨床研究[58]，1針免疫4周后僅有2名兒童HBV表面抗體低效價陽轉(zhuǎn)〔陽性/陰性(positive/negative，P/N)值分別為2.1和2.6)〕，但使用HBV亞單位疫苗加強免疫后，HBV抗體明顯升高(P/N均值為25.2)，效價明顯高于單次HBV亞單位(P/N均值為12.2)。單次HBV亞單位疫苗免疫后4周再使用重組痘苗病毒HBV疫苗加強免疫，可明顯提高HBV抗體效價(P/N均值為54.9)。這些結(jié)果表明，重組痘苗病毒HBV疫苗單次免疫并不能獲得良好免疫，但可有效作為初次免疫或加強免疫與亞單位疫苗聯(lián)合應(yīng)用。這一結(jié)果也提示，重組痘苗病毒載體疫苗并非對所有抗原均有良好免疫效果。

上述3種重組痘苗病毒疫苗在人體中的接種反應(yīng)表明，痘苗病毒天壇株載體引起的痘皰反應(yīng)與親本株非常相近，皮膚反應(yīng)較重，膿皰疹明顯，多數(shù)受試者有37.5 ℃左右發(fā)熱和腋下淋巴結(jié)腫大。鑒于痘苗病毒天壇株較重的接種反應(yīng)及可能出現(xiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，進一步降低其毒力對提高接種的安全性是必要的。對一株在TK區(qū)表達MV的血凝素(hemagglutinin，HA)和融合蛋白(fusion protein，F(xiàn))、在HindⅢ K片段表達人IL-2的重組痘苗病毒MV疫苗(RVJMLHFKIL2)進行了小量人體免疫觀察[59]。動物實驗中，該疫苗在兔皮、鼠腦和裸鼠腹腔的毒力明顯下降，免疫效果與不帶IL-2的無明顯差別。人體試驗中，該疫苗的毒力明顯降低，發(fā)痘率低、痘皰小、發(fā)熱少、無明顯腋下淋巴結(jié)腫大，但免疫效果受到明顯影響。在嬰幼兒中作為初次免疫，血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)和HL的抗體效價明顯低于常規(guī)減毒活疫苗，但在學(xué)齡兒童的加強免疫中該疫苗的加強效果(HI和HL效價)與減毒活疫苗相近，其中HL的效價略高于減毒活疫苗。經(jīng)綜合分析，用痘苗病毒天壇株載體制備的重組活疫苗免疫效果較好，但不同抗原的免疫原性不同，須進行針對性研究。其毒副作用仍較強，與其親本株相近。共表達IL-2的重組疫苗在人體中明顯減毒，但免疫效果也明顯下降。這些結(jié)果提示，通過劃痕接種的重組痘苗病毒活疫苗的免疫效果與其在機體內(nèi)的增殖密切相關(guān)，增殖高，免疫效果好，但毒副作用大；而增殖少，毒副作用少，免疫效果又不好。因此，平衡其增殖能力與免疫效果和毒副作用的關(guān)系是復(fù)制型重組病毒載體疫苗面臨的一個重要研究課題。

7 重組痘苗病毒天壇株載體的其他研究

通過去除特異基因或插入細(xì)胞因子等方法，在降低載體毒力的同時增強其特異免疫效果(如黏膜免疫、細(xì)胞免疫、體液免疫等)的研究取得了較好進展。表達多種人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)抗原的復(fù)制型重組痘苗病毒天壇株HIV疫苗已進入Ⅱ期臨床研究；表達多種HIV抗原的非復(fù)制型重組痘苗病毒天壇株HIV疫苗已完成臨床前研究；使用非復(fù)制型痘苗病毒天壇株載體研發(fā)的新型天花疫苗已申報臨床研究。目前，載體疫苗成功上市應(yīng)用的是獸用載體疫苗。如表達狂犬病毒糖蛋白重組痘病毒疫苗，作為食餌口服的活疫苗在特殊地區(qū)的野外應(yīng)用，用于阻斷狂犬病在狼和狐貍中的傳播；表達禽流感病毒H5N1及新城疫病毒抗原的禽痘載體活疫苗批準(zhǔn)用于雞群禽流感和新城疫的預(yù)防等。在腫瘤治療性疫苗研發(fā)中，一些疫苗已獲批準(zhǔn)并進行了臨床治療研究，展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。

8 載體疫苗存在的問題與出路

20多年來，許多微生物被用作載體進行載體疫苗研究，一些載體疫苗已進入人體試驗階段。大量的動物實驗和人體試驗表明，多數(shù)載體疫苗安全、有效。然而，在曾感染過載體微生物的機體中，如感染過腺病毒或沙門菌，或接種過痘苗或卡介苗的人(或動物)中，因機體對載體微生物已具免疫力，接種相應(yīng)載體疫苗后，一方面會因再次免疫的加強作用形成對載體的優(yōu)勢免疫反應(yīng)；另一方面會因已存在的載體免疫影響重組微生物(載體疫苗)的繁殖，減少目標(biāo)抗原的表達量，從而影響目標(biāo)抗原的免疫效果。所以，影響載體疫苗走向應(yīng)用的最大問題是機體針對載體的免疫反應(yīng)問題：機體預(yù)先存在的載體免疫會影響載體疫苗的初次免疫效果；載體疫苗接種后產(chǎn)生的載體免疫反應(yīng)會影響該疫苗的再次免疫效果；載體免疫反應(yīng)的存在將影響該載體廣泛應(yīng)用于其他疫苗的研發(fā)；不同載體誘發(fā)的免疫反應(yīng)不同，增大了安全評價的復(fù)雜性。這也是為什么載體疫苗研發(fā)近30年來，雖然動物實驗和小量人體試驗表明具有良好免疫效果，但至今仍沒有人用載體疫苗上市的重要原因。解決載體免疫反應(yīng)對載體疫苗免疫效果的影響是將這類疫苗推向?qū)嵱玫年P(guān)鍵。交替使用不同微生物載體或同種微生物不同血清型載體是目前解決載體免疫反應(yīng)的重要策略?？鼓[瘤、持續(xù)感染等治療性疫苗的開發(fā)為適宜的載體疫苗在無相應(yīng)載體免疫反應(yīng)的治療個體中的應(yīng)用提供了可能。很多動物都未曾感染過可用作載體疫苗研發(fā)的微生物，且很多動物生命周期短，有的僅數(shù)月，不會在種群中形成長期特異的載體免疫屏障，這為規(guī)避載體免疫反應(yīng)、開辟載體疫苗研發(fā)的新領(lǐng)域提供了依據(jù)。因此，將載體疫苗技術(shù)用于獸用疫苗的研發(fā)，特別是用于那些生命周期短的動物，就成了揚長避短，解決載體免疫反應(yīng)，發(fā)揮載體疫苗成本低、效果好、易組成多聯(lián)多價的優(yōu)勢，將載體疫苗研究推向應(yīng)用的重要途徑。

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