湯青萍，宋 遲，章雙杰，趙東偉，鄒劍敏

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225003）

我國(guó)是世界第一養(yǎng)鵝大國(guó)，年出欄肉鵝6億多只，占世界鵝出欄總量90%以上，飼養(yǎng)量以年7%的速度遞增[1]。鵝產(chǎn)品消費(fèi)主要以鵝肉為主，肉鵝胸肌和腿肌發(fā)育快慢直接決定其產(chǎn)肉性能和養(yǎng)殖效益。只有充分揭示鵝遺傳背景對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)的影響及其分子調(diào)控機(jī)制，選擇性提高早期肉鵝骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育，才能突破肉鵝育種瓶頸。

動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)控最為關(guān)鍵的是下丘腦-垂體-肌肉生長(zhǎng)軸。禽類生長(zhǎng)激素可以通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growth factors,IGFs）發(fā)揮作用。已有研究證實(shí)，IGF-I可通過(guò)靶器官上IGFs受體（Insulin-like growth factor receptor,IGFR），促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及蛋白合成、抑制蛋白降解，從而促進(jìn)骨骼肌發(fā)育[2-3]。肌肉生成抑制素（Myo?statin，MSTN）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要肌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控因子，屬TGF-β超家族成員之一，主要分布在骨骼肌，對(duì)肌肉生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用。敲除此基因小鼠肌肉量比正常小鼠肌肉量多2～3倍[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌生長(zhǎng)速度存在較大差異的肉雞和蛋雞MSTN基因mRNA表達(dá)水平具有較大差異[7]。目前對(duì)IGF-I、MSTN基因研究在雞上較多，但多集中在基因結(jié)構(gòu)、SNP分析上，對(duì)基因表達(dá)與屠宰性狀相關(guān)分析少有報(bào)道，針對(duì)鵝這一禽種的研究仍是空白。

太湖鵝是我國(guó)著名小型地方鵝種資源，肉質(zhì)優(yōu)良，但早期生長(zhǎng)速度較慢；皖西白鵝體型較大，早期生長(zhǎng)速度快。

本研究以太湖鵝和皖西白鵝為研究素材，應(yīng)用多重?zé)晒飧?jìng)爭(zhēng)性PCR（Multiplex Competitive Fluo?rescent-PCR，MCF-PCR）技術(shù)，研究肌肉中IGF-I和MSTN mRNA表達(dá)的品種、性別和組織特異性，并探討與屠宰性狀相關(guān)性，為鵝骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)鵝選自太湖鵝資源國(guó)家級(jí)保種場(chǎng)同批飼養(yǎng)太湖鵝和皖西白鵝，70日齡，每個(gè)品種30只（公母各半）。采取胸肌和腿肌組織，置于液氮中，轉(zhuǎn)入-70℃低溫冰箱待用。測(cè)定相關(guān)屠宰指標(biāo)。

1.2 主要試劑和儀器

TRNzol-A+總RNA提取試劑（DP421）、Super?Real PreMix（SYBR Green）（FP204-01）、Quant cD?NA第一鏈合成試劑盒（QuantScript RT Kit,KR103-04）、質(zhì)粒小提試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit,DP103-02）、DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒（TIAN?quick Midi Purification Kit,DP204-02）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和pMD18-T Vector購(gòu)自Takara公司；分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)ROX500購(gòu)自Applied Biosystems公司。9700PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 2500）、紫外分光光度計(jì)（GeneQuant II，Pharmacia Biotech）。

1.3 總RNA提取和內(nèi)參選取

肌肉總RNA提取按TRNzol-A+總RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RNA樣品經(jīng)1.4%瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，保證RNA樣品質(zhì)量可靠，計(jì)算樣品總RNA濃度。取2 μg總RNA，cDNA第1鏈合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光定量試驗(yàn)選取β-actin作為內(nèi)參基因。

1.4 引物設(shè)計(jì)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR

引物經(jīng)熒光定量PCR擴(kuò)增，目的基因與內(nèi)參基因，序列見(jiàn)表1。均獲得單一尖銳熔解曲線峰，PCR擴(kuò)增特異性較好。每個(gè)樣本用內(nèi)參基因β-actin做實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所有樣本與內(nèi)參基因CT值均在15～25范圍內(nèi)，每次試驗(yàn)陰性對(duì)照均干凈，符合MCF-PCR試驗(yàn)要求。

表1 目的基因MCF-PCR引物序列Table 1 Primers of target genes used in the MCF-PCR

1.5 多重?zé)晒飧?jìng)爭(zhēng)性PCR

1.5.1 競(jìng)爭(zhēng)性模板制備

競(jìng)爭(zhēng)性模板（內(nèi)對(duì)照）制備分為構(gòu)建克隆和質(zhì)粒酶切兩大步驟。PCR引物是在嵌合特異引物基礎(chǔ)上制備而來(lái)，在特異引物3'端人為摻入3個(gè)堿基，延擴(kuò)增序列方向向后延伸18～22個(gè)堿基即得到制備內(nèi)對(duì)照的引物。經(jīng)PCR后，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌并測(cè)序驗(yàn)證。

1.5.2 質(zhì)粒抽提、酶切

分析測(cè)序結(jié)果，選出構(gòu)建成功的質(zhì)粒，提取質(zhì)粒，抽提效果用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切為線性DNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否酶切徹底。酶切質(zhì)粒經(jīng)純化后，檢測(cè)濃度，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 多重PCR反應(yīng)過(guò)程

優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)反應(yīng)程序使測(cè)序儀可獲得1個(gè)好峰形圖。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為 15 μL，其中 10×GT Buffer（含 34 mmol·L-1Mg2+）1.5 μL,100 mmol·L-1Mg2+0.09 μL，dNTP mix（各 2.5 mmol·L-1）3 μL，Primers 1.5 μL，TaqDNA Polymerase（5 units· μL-1） 0.75 μL， Tem?plates（cDNA） 1.5 μL；BSA（10 mg·mL-1）0.21 μL，質(zhì)粒mix 0.5 μL ，dd H2O 補(bǔ)足15 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性1 min,85℃變性5 min；94℃30 s，59℃30 s，68℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；68℃延伸20 min。

挑選若干個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察產(chǎn)物是否存在、查看陽(yáng)性樣本片段大小、陰性有無(wú)污染，依據(jù)瓊脂糖電泳條帶亮度確定PCR產(chǎn)物電泳時(shí)上樣量。最后通過(guò)ABI 3730測(cè)序儀進(jìn)行電泳分離檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS軟件中Univarinate、One-way ANO?VA和Bivariate Correlation分析品種、性別和組織對(duì)基因表達(dá)影響及其與屠宰性狀相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)以Mean±SE表示，*表示差異顯著，P＜0.05；**表示差異極顯著，P＜0.01。統(tǒng)計(jì)時(shí)以皖西白鵝胸肌IGF-I表達(dá)量為參照。

2 結(jié)果與分析

2.1 70日齡太湖鵝和皖西白鵝屠宰性狀

結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 70日齡太湖鵝和皖西白鵝屠宰性狀比較Table 2 Carcass trait of 70 days Wanxi goose and Taihu goose

從表2可見(jiàn)，品種間，太湖鵝體重、胸肌重、腿肌重都顯著小于皖西白鵝，但胸肌率、腿肌率沒(méi)有品種差異。品種內(nèi)，兩個(gè)品種都是胸肌率母鵝顯著大于公鵝。

2.2 品種對(duì)胸、腿肌中IGF-I和MSTN mRNA表達(dá)作用

從表3可見(jiàn)，胸肌IGF-I mRNA表達(dá)太湖鵝極顯著高于皖西白鵝，腿肌MSTN mRNA表達(dá)量太湖鵝顯著高于皖西白鵝），太湖鵝和皖西白鵝胸肌MSTN mRNA、腿肌IGF-I mRNA沒(méi)有品種差異性。

表3 70日齡太湖鵝和皖西白鵝胸、腿肌中IGF-I和MSTN mRNA表達(dá)Table 3 Expression of IGF-I and MSTN gene in chest and leg muscle of 70 days Wanxi goose and Taihu goose

2.3 性別對(duì)胸、腿肌中IGF-I和MSTN mRNA表達(dá)作用

將兩個(gè)鵝種作為一個(gè)群體，分析性別對(duì)胸肌MSTN mRNA、腿肌中IGF-I mRNA表達(dá)量影響。

從表4可見(jiàn)，腿肌IGF-I mRNA表達(dá)量公鵝極顯著大于母鵝。

表4 70日齡鵝胸肌MSTN mRNA、腿肌中IGF-I mRNA表達(dá)量Table 4 IGF-I and MSTN mRNA expression of breast and leg muscle in gooses at the age of 70 days

從表5可見(jiàn)，太湖鵝胸肌IGF-I mRNA表達(dá)量公鵝顯著高于母鵝。

表5 70日齡太湖鵝和皖西白鵝胸肌IGF-I mRNA、腿肌MSTN mRNA表達(dá)量Table 5 IGF-I and MSTN mRNA expression of breast and leg muscle in Taihu goose and Wanxi goose at the age of 70 days

2.4 胸肌、腿肌組織IGF-I和MSTN mRNA表達(dá)

應(yīng)用配對(duì)T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法，探討鵝胸、腿組織間IGF-I和MSTN mRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)MSTN mRNA表達(dá)量腿肌極顯著高于胸肌，IGF-I mRNA表達(dá)量沒(méi)有組織差異性，詳見(jiàn)表6。

表6 70日齡鵝胸、腿肌MSTN和IGF-I mRNA表達(dá)量Table 6 Expression of IGF-I and MSTN gene in chest and leg muscle of 70 days goose

2.5 鵝胸肌、腿肌中IGF-I和MSTN mRNA表達(dá)與屠宰性狀相關(guān)性

胸肌MSTN mRNA表達(dá)量和腿肌IGF-I mRNA表達(dá)量，由于沒(méi)有品種差異，故將太湖鵝和皖西白鵝看作一個(gè)群體統(tǒng)計(jì)相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)胸肌IGF-I mRNA表達(dá)量和胸肌MSTN mRNA表達(dá)量極顯著相關(guān)（r=0.604）；腿肌IGF-I mRNA表達(dá)量和腿肌MSTN mRNA表達(dá)量極顯著相關(guān)（r=0.715）；腿肌IGF-I mRNA表達(dá)量和胸肌率顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.332）。

分品種分析胸肌IGF-I mRNA和腿肌MSTN mRNA表達(dá)與屠宰性狀相關(guān)性。皖西白鵝腿肌MSTN mRNA表達(dá)量與體重極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.554）、與腿肌重顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.473）。

3 討論與結(jié)論

太湖鵝與皖西白鵝70日齡屠宰性能測(cè)定與前人研究結(jié)果基本相同[8]。品種間，太湖鵝體重、胸肌重、腿肌重都顯著小于皖西白鵝，但胸肌率、腿肌率沒(méi)有品種差異。品種內(nèi)，兩個(gè)品種都是胸肌率母鵝顯著大于公鵝。

胸肌IGF-I mRNA表達(dá)太湖鵝極顯著高于皖西白鵝，腿肌MSTN mRNA表達(dá)量太湖鵝顯著高于皖西白鵝，太湖鵝和皖西白鵝胸肌MSTN mRNA、腿肌IGF-I mRNA沒(méi)有品種差異性。

鵝群體，腿肌IGF-I mRNA表達(dá)量公鵝極顯著大于母鵝。提示，70日齡公鵝腿肌生長(zhǎng)強(qiáng)度大于母鵝。

太湖鵝胸肌IGF-I mRNA表達(dá)量公鵝顯著高于母鵝。唐修君對(duì)太湖鵝屠宰性能的研究發(fā)現(xiàn)[9]，70日齡公鵝胸肌重（262 g）顯著小于母鵝（277 g），91日齡公鵝胸肌重（454 g）、母鵝（460 g），差異不顯著；本研究70日齡太湖鵝胸肌重也是公鵝（85.05 g）小于母鵝（109.27g）。提示，太湖鵝70～90日齡公鵝胸肌生長(zhǎng)速度快于母鵝，說(shuō)明肌肉實(shí)際增長(zhǎng)較IGF-I mRNA高表達(dá)有一定滯后性。

MSTN mRNA表達(dá)量腿肌極顯著高于胸肌，IGFI mRNA表達(dá)量無(wú)組織差異性。由于MSTN mRNA有抑制肌肉生長(zhǎng)作用，提示70日齡仔鵝胸肌生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于腿肌。與湯青萍[10]研究結(jié)果一致。

鵝群體，胸肌IGF-I mRNA表達(dá)量和胸肌MSTN mRNA表達(dá)量極顯著相關(guān)（r=0.604）；腿肌IGF-I mRNA表達(dá)量和腿肌MSTN mRNA表達(dá)量極顯著相關(guān)（r=0.715）。提示，當(dāng)促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)的IGF-I mRNA表達(dá)量上調(diào)時(shí)，為避免肌肉細(xì)胞過(guò)分肥大抑制肌肉生長(zhǎng)的MSTN mRNA表達(dá)也同時(shí)上調(diào)，從而使肌肉組織中各類基因表達(dá)水平處于動(dòng)態(tài)平衡，協(xié)同調(diào)節(jié)生長(zhǎng)，本結(jié)論與胡蘭[11]、Tokuhisa Abo[12]研究結(jié)果一致。腿肌IGF-I mRNA表達(dá)量和胸肌率顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.332），這可能是因?yàn)镮GFI mRNA促進(jìn)腿肌生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致胸肌在整個(gè)屠體中所占比例降低。

皖西白鵝腿肌MSTN mRNA表達(dá)量與體重極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.554），與腿肌重顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.473），間接驗(yàn)證前人對(duì)MSTN抑制肌肉生長(zhǎng)的研究結(jié)果[5-6,13]。

本文分析太湖鵝與皖西白鵝70日齡肌肉中IGF-I和MSTN mRNA表達(dá)的品種、性別和組織特異性，并探討與屠宰性狀的相關(guān)性。研究結(jié)果可見(jiàn)IGF-I和MSTN對(duì)調(diào)節(jié)鵝骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用。本研究完善了IGF-I和MSTN對(duì)鵝肌肉生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可為提高鵝屠宰性狀遺傳標(biāo)記提供新手段。

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