劉婭平，張建明，劉 群，馮世海，趙永健，施 耘，肖長(zhǎng)栓

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市第四醫(yī)院燒傷科，天津300222）

吸入性損傷是一種多數(shù)發(fā)生在封閉火場(chǎng)、病情發(fā)展迅猛的燒傷危重癥，患者的死亡率極高。雖然有研究證明某些炎癥介質(zhì)參與了吸入性損傷及其全身繼發(fā)性損害，但尚無(wú)控制這些炎癥因子的臨床治療方法。使用有效藥物及其給藥時(shí)間可能對(duì)患者病情發(fā)展有較強(qiáng)的干預(yù)作用。有研究表明，槲皮素具有清除氧自由基的作用，在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中，槲皮素通過(guò)抑制活性氧和活性氮起到抗氧化應(yīng)激的作用[1]。對(duì)吸入性肺損傷的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)槲皮素對(duì)大鼠煙霧吸入性損傷模型的預(yù)防性治療作用，研究其對(duì)自由基及炎癥介質(zhì)的影響及對(duì)肺水清除的作用，探討其對(duì)煙霧吸入性肺損傷的預(yù)防和治療作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 槲皮素（Sigma公司），IL-6ELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司），大鼠SOD試劑盒、MDA試劑盒、iNOS試劑盒（南京建成公司），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS），ELX800UV酶標(biāo)檢測(cè)儀（BIO-TEK），微量加樣器（eooendorf），Centrifuge5702離心機(jī)（EPPENDORF公司），LEICA石蠟切片機(jī)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g（天津春樂(lè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供）。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（A組）、致傷空白組（B組）、槲皮素治療組（C組）、槲皮素預(yù)防組（D組），每組10只。D組在致傷前10min腹腔注射槲皮素（200mg/kg）。除A組外，其余各組參照相關(guān)文獻(xiàn)[2]制作大鼠煙霧吸入性損傷模型。C組在致傷后3h腹腔注射槲皮素（200mg/kg），B組于致傷后3h腹腔注射等量的生理鹽水，A組無(wú)處理。上述過(guò)程中無(wú)大鼠死亡等意外情況發(fā)生。

1.3 標(biāo)本采集 各組于傷后72h取腹主動(dòng)脈血5mL，以3000r/min離心15min后，留上清液，于-20℃冰箱凍存待測(cè)TNF-α，IL-6。將大鼠處死，取其左肺迅速凍存于-70℃冰箱中待測(cè)MDA、SOD、iNOS。以4%甲醛灌洗肺動(dòng)脈，以右肺用絲線(xiàn)扎緊肺門(mén)，置于4%甲醛中固定，留待做病理切片檢查。取少量右肺組織做肺組織干濕比。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) （1）按照試劑盒說(shuō)明書(shū)以雙抗體夾心ELISA法測(cè)血清IL-6（pg/mL）、TNF-α（ng/L）含量。（2）用濾紙將肺組織表面吸凈，制成勻漿，采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法測(cè)勻漿液中蛋白濃度。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別測(cè)定SOD（U/mg）、MDA（nmol/ mg）、iNOS（U/mg）活力。（3）將留待病理以4%甲醛固定好的右肺組織脫水、石蠟包埋、切片，在蘇木精-伊紅（HE）染色后行光鏡觀察。（4）取少量右肺組織稱(chēng)重后置于80℃恒溫烤箱中48h，取出稱(chēng)干重，肺含水量=（肺濕重-肺干重）/肺干重。

2 結(jié)果

2.1 肺病理切片檢查 光學(xué)顯微鏡下，A組肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔均勻，肺泡壁均勻光滑（圖1）。B組組織表現(xiàn)為肺泡不同程度擴(kuò)張或萎陷，大小形態(tài)明顯異常，肺泡結(jié)構(gòu)模糊不清，肺泡間隔不均勻，肺間質(zhì)和肺泡壁內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）。C組組織水腫較B組明顯減輕，部分肺泡大小形態(tài)可見(jiàn)異常，毛細(xì)血管擴(kuò)張，管周仍有少量紅、白細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出輕于B組（圖3）。D組損傷程度又小于C組（圖4）。

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平的比較 見(jiàn)表1。與A組比較，B、C、D組IL-6及TNF-α水平明顯升高（P<0.01）。與B組比較，C、D組TNF-α水平及IL-6水平顯著降低（P<0.01）。與C組比較，D組TNF-α水平及IL-6水平顯著降低（P<0.01）。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

與A組相比#P<0.01，▲P<0.01，△P<0.01；與B組相比#P<0.01，▲P<0.01；與C組相比#P<0.01

組別A組B組C組D組n 10101010TNF-α/(pg/mL）106.12±3.07245.92±2.51△209.61±5.85▲158.23±4.43# IL-6/(pg/mL) 140.21±26.15210.04±2.02△182.59±4.08▲150.89±2.89#

2.3 各組大鼠肺組織MDA、SOD、iNOS水平的比較 見(jiàn)表2。與A組比較，B、C、D組MDA及iNOS水平顯著升高（P<0.01），SOD水平顯著降低（P< 0.01）。與B組比較，C、D組MDA、iNOS含量顯著降低（P<0.01），SOD水平顯著升高（P<0.01）。與C組比較，D組MDA、iNOS含量顯著降低（P<0.01），SOD水平顯著升高（P<0.01）。

表2 各組大鼠肺組織MDA、iNOS、SOD水平比較（±s）Tab 2 Comparison of SOD,iNOS，MDA in the lung tissue of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠肺組織MDA、iNOS、SOD水平比較（±s）Tab 2 Comparison of SOD,iNOS，MDA in the lung tissue of rats in each group（±s）

與A組相比#P<0.01，▲P<0.01，△P<0.01；與B組相比▲P<0.01，#P<0.01；與C組相比#P<0.01

組別A組B組C組D組n 10101010MDA/(nmol/mg) 2.39±0.154.06±0.35△3.65±0.46▲2.97±0.56# iNOS/（U/mg) 0.77±0.412.01±0.26△1.74±0.31▲1.25±0.32# SOD/（U/mg) 361.32±2.0852.03±0.64△254.35±1.15▲312.67±0.98#

2.4 各組大鼠肺組織含水量的比較 見(jiàn)表3。與A組比較，B、C、D組肺含水量均升高（P<0.01）。與B組比較，C、D組肺含水量均降低（P<0.01）。與C組比較，D組肺含水量降低（P<0.05）。

表3 各組大鼠肺組織含水量的比較（±s）Tab 3 Comparison of the water content of the lung tissue of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠肺組織含水量的比較（±s）Tab 3 Comparison of the water content of the lung tissue of rats in each group（±s）

與A組相比#P<0.01，▲P<0.01，△P<0.01；與B組相比，▲P<0.01，#P<0.01；與C組相比#P<0.01

組別A組B組C組D組n 10101010肺組織含水量/（g/g) 3.34±0.657.76±0.35△6.45±0.76▲5.57±0.86#

3 討論

研究表明，自由基產(chǎn)生和釋放的增加導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)在肺損傷的發(fā)病機(jī)制中十分重要[3]，當(dāng)機(jī)體清除氧自由基的能力下降時(shí)，肺組織產(chǎn)生的氧自由基最易損傷肺臟的組織細(xì)胞從而造成肺損傷。槲皮素的化學(xué)名稱(chēng)為（3,3,4,5,7-）五羥基黃酮，具有酚羥基，屬于黃酮類(lèi)化合物中的黃酮醇亞類(lèi)，黃酮類(lèi)化合物的酚羥基H就是與自由基反應(yīng)的最大可能活性部位，通過(guò)與自由基發(fā)生抽氫反應(yīng)消除自由基起到抗氧化作用。槲皮素可憑借其含有的酚羥基基團(tuán)發(fā)揮清除自由基和抗過(guò)氧化的作用。槲皮素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集和清除自由基等多種生物學(xué)活性[4]，吸入性損傷也具有上述病變中存在的過(guò)氧化等問(wèn)題，因此筆者推斷槲皮素可能對(duì)吸入性肺損傷具有良好的預(yù)防和治療效果。

本實(shí)驗(yàn)病理切片顯示致傷組大鼠肺泡不同程度擴(kuò)張或萎陷，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡間隔不均勻，證明煙霧吸入性損傷模型制作成功，效果穩(wěn)定可靠。

肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在煙霧吸入性損傷的致傷過(guò)程中可釋放TNF-α、IL-6等各種細(xì)胞因子，并有花生四烯酸、蛋白酶等代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，形成肺水腫及管型，使肺血管氧含量降低[5]。IL-6和TNF-α是引起肺損傷的重要促炎癥介質(zhì)，通過(guò)生成細(xì)胞因子和炎癥趨化因子激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增加內(nèi)皮黏附因子的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[6]。在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)血清IL-6及TNF-α含量，間接反映肺組織炎性損傷的程度。在實(shí)驗(yàn)中，按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，對(duì)C組采用槲皮素200mg/kg腹腔注射作為實(shí)驗(yàn)劑量，并觀察其肺治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B、C、D組血清TNF-α及IL-6水平較A組顯著升高，而C組較B組TNF-α及IL-6水平降低，D組較C組水平更低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了槲皮素能有效緩解吸入性損傷造成的肺損傷，且預(yù)防性用藥效果更好。

本實(shí)驗(yàn)病理切片結(jié)果顯示，致傷后肺泡結(jié)構(gòu)模糊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，C組肺泡結(jié)構(gòu)較B組清晰，肺毛細(xì)血管管周及肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且預(yù)防性給藥病理變化減輕。有研究表明，肺干濕比的變化可反映肺損傷程度的變化[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C組較B組肺干濕比降低，D組又較C組低。所有這些結(jié)果進(jìn)一步證明槲皮素可減輕吸入性損傷引起的肺損傷，且預(yù)防效果顯著。煙霧吸入性損傷后，機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基，使內(nèi)皮細(xì)胞受損，造成MDA含量增加，SOD的含量劇烈下降。SOD是生理狀態(tài)下體內(nèi)的一種特異性酶，其活性的高低反映了機(jī)體氧自由基的清除能力[9]。因MDA也稱(chēng)脂質(zhì)過(guò)氧化物酶，所以通過(guò)檢測(cè)MDA活性來(lái)間接反映組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的嚴(yán)重程度[10]。肺組織中iNOS的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致NO的過(guò)度生成，而過(guò)量的NO可刺激巨噬細(xì)胞釋放大量的炎癥介質(zhì)，加重肺組織損傷。通過(guò)檢測(cè)iNOS活性反映肺損傷的程度[11]。研究表明，槲皮素具有清除氧自由基和抗過(guò)氧化的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，C組較B組MDA、iNOS水平降低，SOD水平增高，且D組上述變化更明顯。提示槲皮素可通過(guò)清除自由基和抗過(guò)氧化減輕吸入性損傷造成的肺損傷，預(yù)防性用藥效果更好。

綜上，槲皮素可通過(guò)清除氧自由基和抗過(guò)氧化而對(duì)吸入性肺損傷起到一定的預(yù)防治療作用，且預(yù)防用藥效果更好，但是可否用于臨床治療及在具體治療中用藥劑量、濃度，給藥方式等還須進(jìn)一步研究探討。

（本文圖1～4見(jiàn)封三）

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