崔中水，孫保存，趙 楠，趙秀蘭，董學(xué)易，古 強(qiáng)

（1.天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，天津300060）

自1999年Maniotis等[1]發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）這一新的腫瘤血供模式以來，國內(nèi)外眾多學(xué)者致力于其具體發(fā)生機(jī)制的研究，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）即是其中一種[2-4]。經(jīng)典的EMT調(diào)控蛋白Snail和Slug是通過結(jié)合E-cadherin轉(zhuǎn)錄的E-box抑制其表達(dá)，但近年研究發(fā)現(xiàn)Twist1還可以通過其他未知途徑廣泛地抑制上皮樣表型并上調(diào)間充質(zhì)表型，而且Bcl-2可以與Twist1協(xié)同作用，輔助Twist1入核，從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促進(jìn)VM的形成[5-6]。miRNAs（microRNAs）是一類單鏈非編碼內(nèi)源性小分子RNA，其轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他基因，并不翻譯成蛋白質(zhì)，而是在體內(nèi)代謝過程中起調(diào)控作用。近年來國內(nèi)外均有報(bào)道m(xù)iRNA在腫瘤中異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的miRNA可以通過激活原癌基因的表達(dá)和抑癌基因的突變?nèi)笔?，從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。因此，我們推測Bcl-2與Twist1協(xié)同作用激活多個(gè)下游靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄活性是否可能是通過miRNAs表達(dá)變化來實(shí)現(xiàn)的？本實(shí)驗(yàn)通過分析對(duì)比Twist1、Bcl-2分別單獨(dú)過表達(dá)和共過表達(dá)時(shí)的miRNA譜，旨在找出與Twist1和Bcl-2協(xié)同作用相關(guān)的miRNAs。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和培養(yǎng)條件 肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系HepG2，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，美國）。

全部細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)模式進(jìn)行:培養(yǎng)基為Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）添加10%胎牛血清（FBS），均購自Invitrogen公司（美國）。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2：恒濕環(huán)境（Binder培養(yǎng)箱，德國）。按不同要求，細(xì)胞傳代擴(kuò)增至60%～80%接觸匯合后收獲細(xì)胞。

1.2 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 Twist1基因CDS全長通過全基因合成（華大公司，深圳）獲得，亞克隆入pcDNA3后測序，與Genebank序列比對(duì)確定正確開放閱讀框用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；表達(dá)上調(diào)質(zhì)粒pcDNA3-Bcl2通過cDNA文庫亞克隆獲得，經(jīng)過測序驗(yàn)證。

1.3 質(zhì)粒提取和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以DH5α超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌擴(kuò)增穿梭質(zhì)粒，常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，氨芐青霉素抗性篩選單克隆，質(zhì)粒大提，以TritonXll4抽提法去除內(nèi)毒素。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用新型轉(zhuǎn)染試劑：聚乙酞亞胺（percutanoous ethanol injection，pEI，polyseienee公司，Cat#23966）。細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%接觸匯合，轉(zhuǎn)染前一天更換為無血清培養(yǎng)液同步化細(xì)胞，轉(zhuǎn)染當(dāng)日首先更換無血清、無抗生素新鮮培養(yǎng)液，以1∶4比例混勻質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑，加入培養(yǎng)基，次日更換為條件培養(yǎng)液。24～48h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià)或其他實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染效率和蛋白分析效果如高于50%可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 miRNA芯片分析 采用空質(zhì)粒、穩(wěn)轉(zhuǎn)Twistl、穩(wěn)轉(zhuǎn) Bcl-2和穩(wěn)轉(zhuǎn) Twist1/Bcl-2分別獲得的HepG2-對(duì)照、HepG2-Twist1、HepG2-Bcl-2、HepG2-Twist1/Bcl-24組細(xì)胞作為樣品，利用miRNA芯片技術(shù)方法檢測不同處理對(duì)miRNA表達(dá)譜的影響。實(shí)驗(yàn)由北京博奧公司完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)輸入SPSS 13.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分別采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)（Student’s t test）和多組比較單因素方差分析（ANOVA），以P<0.01作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 共過表達(dá)Twist1/Bcl-2組與對(duì)照組比較miRNA表達(dá)譜 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-對(duì)照組有11個(gè)miRNA表達(dá)高，有37個(gè)表達(dá)低（P< 0.01）（圖1）。其中有2個(gè)miRNA表達(dá)高10倍以上（表1），有1個(gè)表達(dá)低10倍以上（表2）。

表1 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-對(duì)照組表達(dá)高10倍以上的miRNATab 1 The miRNAs that expressed more than 10times higher in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2control group

表2 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-對(duì)照組表達(dá)低10倍以上的miRNATab 2 The miRNAs that expressed more than 10times lower in the HepG2-Twist1/Bcl-2groupthanintheHepG2controlgroup

2.2 共過表達(dá)Twist1/Bcl-2組與過表達(dá)Twist1組比較miRNA表達(dá)譜 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Twist1組有13個(gè)miRNA表達(dá)高，42個(gè)表達(dá)低（P<0.01）（圖2）。其中有6個(gè)miRNA表達(dá)高10倍以上（表3），1個(gè)表達(dá)低10倍以上（P<0.01）（表4）。

表3 HepG2-Twistl/Bcl-2組比HepG2-Twistl組表達(dá)高10倍以上的miRNATab 3 The miRNAs that expressed more than 10times higher in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2-Twist1group

表4 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Twist1組表達(dá)低10倍以上的miRNATab 4 The miRNAs that expressed more than 10times lower in the HepG2-Twist1/Bcl-2groupthanintheHepG2-Twist1group

2.3 共過表達(dá)Twist1/Bcl-2組與過表達(dá)Bcl-2組比較miRNA表達(dá)譜 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Bcl-2組有17個(gè)miRNA表達(dá)高，24個(gè)表達(dá)低（P<0.01）（圖3）。其中有2個(gè)miRNA表達(dá)高10倍以上（表5），2個(gè)表達(dá)低10倍以上（表6）。

表5 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Bcl-2組表達(dá)高10倍以上的miRNATab 5 The miRNAs that expressed more than 10times higher in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2-Bcl-2group

表6 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Bcl-2組表達(dá)低10倍以上的miRNATab 6 The miRNAs that expressed more than 10times lower in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2-Bcl-2group

3 討論

miRNAs是由染色體DNA編碼，并在進(jìn)化上高度保守，在細(xì)菌、病毒、真菌、植物和動(dòng)物中都廣泛表達(dá)。其功能機(jī)制是在細(xì)胞核首先由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成初始轉(zhuǎn)錄子（pri-miRNA），pri-miRNA經(jīng)蛋白復(fù)合體處理后形成miRNA前體（pre-miRNA，約70nt），pre-miRNA在胞質(zhì)被Dicer（核酸內(nèi)切酶RNaseⅢ）剪切成雙鏈miRNA，雙鏈中的一條與含Argonautes的RNA沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）形成RISC-miRNA復(fù)合物后與靶基因mRNA的3′UTR（3′非翻譯區(qū)）完全或不完全的堿基互補(bǔ)結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)其負(fù)性調(diào)節(jié)靶mRNA的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA具有調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)功能[4]。miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有著密切的關(guān)聯(lián)。各種研究相繼報(bào)道了miRNA差異表達(dá)與惡性轉(zhuǎn)化標(biāo)志（異常細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移）之間的分子功能聯(lián)系[4]。

本研究即是針對(duì)EMT相關(guān)蛋白Twist1與抗凋亡蛋白Bcl-2共表達(dá)時(shí)出現(xiàn)的miRNA表達(dá)譜變化來初步分析Twist1和Bcl-2相互作用引發(fā)廣泛生物學(xué)效應(yīng)是否與某些miRNA相關(guān)。miRNA芯片結(jié)果表明：共過表達(dá)Twist1/Bcl-2可引起miRNA表達(dá)譜發(fā)生較明顯變化，且其發(fā)生變化的miRNA數(shù)量和范圍都不同于Twist1、Bcl-2單獨(dú)任何一者過表達(dá)時(shí)的表達(dá)變化情況。

本實(shí)驗(yàn)組前期研究已經(jīng)驗(yàn)證了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果是高效率的，而且表明Twist1能調(diào)控EMT表征蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)、VE-cadherin表達(dá)上調(diào)進(jìn)而促進(jìn)EMT、VM，且共過表達(dá)Twist1/Bcl-2能使Twist1這一功能更強(qiáng)；通過比較4組細(xì)胞的功能發(fā)現(xiàn)共過表達(dá)Twist1/Bcl-2組的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和體內(nèi)成瘤及在3D培養(yǎng)條件下形成管道等能力都比其他組明顯要強(qiáng)[3]。本文利用miRNA芯片技術(shù)分析了空白對(duì)照、單獨(dú)過表達(dá)Twist1、單獨(dú)過表達(dá)Bcl-2和共過表達(dá)Twist1/Bcl-24組細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，初步發(fā)現(xiàn)同時(shí)過表達(dá)Bcl-2和Twist1可使miRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯變化，并且與單獨(dú)過表達(dá)Twist1或Bcl-2時(shí)發(fā)生的變化都不同，這表明Twist1和Bcl-2相互作用使更廣泛的miRNAs發(fā)生了變化或使變化更明顯，從而使得細(xì)胞功能產(chǎn)生非常廣泛的影響，甚至完全顛覆細(xì)胞表型。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HepG2-Twist1/Bcl-2組與其他組相比差異倍數(shù)在10倍以上的miRNA有9個(gè)：hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-155、hsa-miR-1914、hsa-miR-424、hsa-miR-1246、hsa-miR-146a、hsamiR-200b、hsa-miR-4286、hsa-miR-193a-3p。在關(guān)于這9個(gè)miRNA在腫瘤生物學(xué)功能方面的研究中，miR-146b-5p通過靶向基質(zhì)金屬蛋白酶MMP16抑制神經(jīng)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[8]；miR-155經(jīng)常在一些癌癥中過表達(dá)，下調(diào)腫瘤抑制蛋白p53的表達(dá)，該蛋白與細(xì)胞凋亡相關(guān)[9]；hsamiR-1914尚未有研究發(fā)表；miR-424在腫瘤局部缺氧組織的血管重構(gòu)及血管生成中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[10]；has-miR-1246是細(xì)胞周期、凋亡和衰老相關(guān)基因p53家族的一個(gè)靶基因，并可通過抑制DYRK1A的表達(dá)激活NFAT，而NFAT的激活與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[11]；在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，hsamiR-146a在去勢抵抗性前列腺癌中成低表達(dá)，并且過表達(dá)hsa-miR-146a可抑制體外腫瘤細(xì)胞生長、克隆形成和遷移以及體內(nèi)成瘤性和血管形成等功能，其機(jī)制研究表明hsa-miR-146a可靶向抑制EGFR的表達(dá)，并可抑制MMP2的表達(dá)[12]；miR-200家族（miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-141, and miR-429）是一類與EMT高度相關(guān)的miRNAs，而miR-200b被認(rèn)為是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和化學(xué)敏感性等的關(guān)鍵調(diào)控子[13]；hsa-miR-4286在皮膚黑色素瘤中表達(dá)比良性黑色素痣明顯上調(diào)，但其發(fā)揮的具體作用目前尚未有發(fā)表[14]；hsa-miR-193a-3p在乳腺癌中作為腫瘤抑制因子通過與miR-124和miR-147共同靶向作用于EGFR進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程[15]。

在HepG2-Twist1/Bcl-2組發(fā)生變化的miRNA涉及異常細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等多種功能，因此我們推測Twist1和Bcl-2協(xié)同作用使上述9個(gè)關(guān)鍵的miRNA發(fā)生明顯的表達(dá)變化，導(dǎo)致miRNA對(duì)多個(gè)下游靶基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用發(fā)生改變，這些靶基因與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、血管生成、細(xì)胞骨架形成等多方面有關(guān)，結(jié)果不僅增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等惡性功能，而且誘導(dǎo)了EMT的發(fā)生及VM形成，最終促進(jìn)腫瘤惡性及進(jìn)展。但這些在HepG2-Twist1/Bcl-2組發(fā)生變化的miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具體發(fā)揮什么功能，哪些是與Twist1和Bcl-2的相互作用直接相關(guān)的miRNA以及調(diào)控VM和EMT的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究利用miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)共過表達(dá)Twist1/Bcl-2的HepG2肝癌細(xì)胞中miRNA發(fā)生明顯的差異表達(dá)，結(jié)合功能變化結(jié)果說明眾多miRNA發(fā)生表達(dá)變化可起到共同調(diào)控下游多個(gè)靶基因活性的作用，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究Twist1和Bcl-2相互作用引發(fā)腫瘤廣泛生物學(xué)效應(yīng)的具體機(jī)制提供了有用的數(shù)據(jù)庫，而篩選出Twist1和Bcl-2可直接調(diào)控的miRNA并進(jìn)行驗(yàn)證以及對(duì)這些miRNA進(jìn)行功能學(xué)的研究則是作者下一步即將開展的工作。

［1］ Maniotis A J,Folberg R,Hess A,et al.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro:vasculogenic mimicry[J].Am J Pathol,1999,155（3）:739

［2］ Seftor R E,Hess A R,Seftor E A,et al.Tumor cell vasculogenic mimicry:from controversy to therapeutic promise[J].Am J Pathol, 2012,181（4）:1115

［3］ Kang Y,Massague J.Epithelial-mesenchymal transitions:twist in development and metastasis[J].Cell,2004,118（3）:277

［4］ Yang J,Weinberg R A.Epithelial-mesenchymal transition:At the crossroads of development and tumor metastasis[J].Developmental Cell,2008,14（6）:818

［5］ Zhao X L,Sun T,Che N,et al.Promotion of hepatocellular carcinoma metastasis through matrix metalloproteinase activation by epithelial-mesenchymal transition regulator Twist1[J].J Cell Mol Med,2011,15（3）:691

［6］ Sun T,Sun B C,Zhao X L,et al.Promotion of tumor cell metastasis and vasculogenic mimicry by way of transcription coactivation by Bcl-2and Twist1:A study of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2011,54（5）:1690

［7］ Chen C Z.MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J].N Engl J Med,2005,353（17）:1768

［8］ Geraldo M V,Yamashita A S,Kimura E T.MicroRNA miR-146b-5p regulates signal transduction of TGF-beta by repressing SMAD4in thyroid cancer[J].Oncogene,2012,31（15）:1910

［9］ 譚志琴，劉伏香，唐海林.子宮內(nèi)膜癌患者血清has-miR-155的表達(dá)及其臨床意義[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2010，45（10）:772

［10］ Ghosh G,Subramanian I V,Adhikari N,et al.Hypoxia-induced microRNA-424expression in human endothelial cells regulates HIF-alpha isoforms and promotes angiogenesis[J].Clin Invest, 2010,120（11）:4141

［11］Liao J M,Zhou X,Zhang Y,et al.MiR-1246:a new link of the p53family with cancer and Down syndrome[J].Cell Cycle,2012,11（14）:2624

［12］Xu B,Wang N,Wang X,et al.MiR-146a suppresses tumor growth and progression by targeting EGFR pathway and in a p-ERK-dependent manner in castration-resistant prostate cancer[J].Prostate, 2012,72（11）:1171

［13］Feng B,Wang R,Chen L B.Review of MiR-200b and cancer chemosensitivity[J].Biomed Pharmacother,2012,66（6）:397

［14］Mohan K V,Devadas K,Sainath Rao S,et al.Identification of XMRV infection-associated microRNAs in four cell types in culture [J].PLoS One,2012,7（3）:e32853

［15］Uhlmann S,Mannsperger H,Zhang J D,et al.Global microRNA level regulation of EGFR-driven cell-cycle protein network in breast cancer[J].Mol Syst Biol,2012,8:570