陳 雷 劉新亮 王歡利 汪貴斌 陳柳馨 曹福亮

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

銀杏(Ginkgo biloba)原產(chǎn)于我國(guó)，是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)林以及觀賞樹(shù)種。它既可作為園林綠化樹(shù)種，也是優(yōu)良用材樹(shù)種，特別是葉片中富含兩種重要的次生代謝產(chǎn)物——黃酮類(lèi)和萜類(lèi)化合物，具有極高的藥用價(jià)值［1］。通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)快速大量的擴(kuò)繁銀杏愈傷組織，進(jìn)而獲取銀杏次生代謝產(chǎn)物具有極其廣闊的發(fā)展前景。組織培養(yǎng)作為一種加速繁育速度，縮短育種周期的無(wú)性繁殖手段，廣泛地用于各類(lèi)植物中［2］。同時(shí)，組織培養(yǎng)所獲得的愈傷組織也是次生代謝物生產(chǎn)的理想材料，因此，對(duì)銀杏愈傷組織的研究存在著重大意義。迄今為止，現(xiàn)有對(duì)銀杏愈傷組織培養(yǎng)的研究多集中在器官組織培養(yǎng)［3－4］、培養(yǎng)基及外源激素選擇［5－7］等方面，但是，微量元素對(duì)銀杏愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，文中采用切除胚根的成熟胚作為外植體，在含有不同種類(lèi)及質(zhì)量濃度微量元素的MS 培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生和生長(zhǎng)，旨在找到最優(yōu)的微量元素組合，并揭示影響愈傷組織產(chǎn)生和生長(zhǎng)的主要影響元素，為銀杏愈傷組織的誘導(dǎo)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系建立提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

銀杏種子采自泰興30年生佛指銀杏，采摘去外種皮后種核在冰箱中4 ℃保存。接種前，種核用0.1%升汞消毒8 min，無(wú)菌水清洗5 次，每次10 min。在超凈工作臺(tái)上將切去胚根的成熟胚接種于含有不同種類(lèi)及質(zhì)量濃度微量元素的MS +NAA 1.5 mg·L－1+6 －BA 2 mg·L－1+蔗糖35 g·L－1+瓊脂7.5 g·L－1培養(yǎng)基。

本試驗(yàn)主要為考察MS 培養(yǎng)基中微量元素Mo、B、Mn、Cu、Co 質(zhì)量濃度變化對(duì)胚愈傷的影響，采用L16(45)正交設(shè)計(jì)，每個(gè)因子分為4 個(gè)水平。設(shè)計(jì)的因子水平如表1所示，其中，水平2 為標(biāo)準(zhǔn)MS 培養(yǎng)基所添加值?？傆?jì)配成A1B1C1D1E1、A1B2C2D2E2、A1B3C3D3E3、A1B4C4D4E4、A2B1C2D3E4、A2B2C1D4E3、A2B3C4D1E2、A2B4C3D2E1、A3B1C3D4E2、A3B2C4D3E1、A3B3C1D2E4、A3B4C2D1E3、A4B1C4D2E3、A4B2C3D1E4、A4B3C2D4E1、A4B4C1D3E2，其中1、2、3、4 分別代表各因子相對(duì)應(yīng)的4 個(gè)水平。每個(gè)處理6 ～10 瓶，每瓶接種3 株。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) mg·L －1

愈傷組織誘導(dǎo)率測(cè)定:胚接種7 d 后計(jì)算愈傷組織的誘導(dǎo)率。以出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的愈傷組織記為外植體的愈傷發(fā)生時(shí)間，40 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的褐化率。

愈傷組織的誘導(dǎo)率=(出現(xiàn)愈傷組織的外植體數(shù)/總的接種外植體數(shù))×100%。

褐化率=(褐化的愈傷數(shù)/愈傷總數(shù))×100%。

愈傷組織生長(zhǎng)量的測(cè)定:培養(yǎng)35 d 后，將愈傷組織從培養(yǎng)瓶中取出，用電子天平稱其鮮質(zhì)量，其中:愈傷組織生長(zhǎng)量=培養(yǎng)后愈傷組織鮮質(zhì)量－接種時(shí)鮮質(zhì)量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel、SAS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，并用Duncan 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微量元素對(duì)銀杏愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率及生長(zhǎng)量的影響

在接種后，平均培養(yǎng)4 d 便可觀察到明顯的銀杏愈傷組織。正交設(shè)計(jì)方差分析如表2所示。方差分析表明，不同微量元素質(zhì)量濃度顯著影響了銀杏胚愈傷組織誘導(dǎo)率(p ＜0.01)。從表3的多重對(duì)比結(jié)果可以看出，當(dāng)Na2MoO4·2 H2O 添加量達(dá)到1.250 mg·L－1時(shí)，銀杏愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到85.84%，顯著高于其他水平。這也說(shuō)明過(guò)高或者過(guò)低的Na2MoO4·2H2O 質(zhì)量濃度會(huì)抑制愈傷組織誘導(dǎo)。而對(duì)于B 元素來(lái)說(shuō)，高質(zhì)量濃度的H3BO3并不會(huì)抑制愈傷組織誘導(dǎo)，反而能夠起到促進(jìn)作用，在H3BO3添加量達(dá)到24.800 mg·L－1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最大值，為81.99%。顯著高于最低質(zhì)量濃度水平(3.100 mg·L－1)，然而與其他兩質(zhì)量濃度間并不存在顯著差異。試驗(yàn)中，最低質(zhì)量濃度的MnSO4·4H2O 并不利于銀杏愈傷組織誘導(dǎo)，然而當(dāng)MnSO4·4H2O 添加量達(dá)到22.300 mg·L－1時(shí)，其誘導(dǎo)率達(dá)到81.81%，然而，繼續(xù)提高添加量并不能顯著改變愈傷組織誘導(dǎo)率。銀杏愈傷組織誘導(dǎo)率隨著CuSO4·5H2O 添加量的上升而上升，但是在0. 025、0.250、0.500 mg·L－13 個(gè)水平下并無(wú)顯著差異。與Na2MoO4·2H2O 相似，高質(zhì)量濃度或者低質(zhì)量濃度的CoCl2·6H2O 抑制了銀杏愈傷組織誘導(dǎo)。但是，在0.025、0.125 mg·L－1水平下并無(wú)顯著差異。

表2 微量元素處理對(duì)銀杏愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率及生長(zhǎng)量正交設(shè)計(jì)方差分析

褐化是植物愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)的現(xiàn)象。方差分析表明，除了Cu 元素外。其他微量元素質(zhì)量濃度對(duì)銀杏愈傷組織褐化產(chǎn)生了極為顯著的影響(p ＜0.01)。從表3可知，銀杏愈傷組織褐化率隨著Na2MoO4·2H2O 質(zhì)量濃度的上升而上升，但是卻隨著H3BO3和MnSO4·4H2O 質(zhì)量濃度的上升呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而對(duì)CuSO4·5H2O 來(lái)說(shuō)，過(guò)高和過(guò)低的質(zhì)量濃度均會(huì)導(dǎo)致褐化率的上升，但是CuSO4·5H2O 的質(zhì)量濃度對(duì)愈傷組織褐化率的影響并沒(méi)有達(dá)到極為顯著水平(0.01 ＜p ＜0.05)。與CuSO4·5H2O 相反，高質(zhì)量濃度和低質(zhì)量濃度的CoCl2·6H2O 元素卻能抑制銀杏愈傷組織的褐化。

銀杏愈傷組織生長(zhǎng)量是評(píng)價(jià)細(xì)胞培養(yǎng)體系優(yōu)劣的重要因素。微量元素的質(zhì)量濃度顯著影響了銀杏愈傷組織生長(zhǎng)量(p ＜0.01)。從表3中可以看出:銀杏愈傷組織生長(zhǎng)量隨著Na2MoO4·2H2O 質(zhì)量濃度的上升而減少，在Na2MoO4·2H2O 添加量上升到3.750 mg·L－1時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)量?jī)H為14.89 g，顯著低于其他水平。但是，愈傷組織生長(zhǎng)量隨著H3BO3和CuSO4·5H2O 質(zhì)量濃度的上升而上升，在質(zhì)量濃度最大時(shí)，銀杏愈傷組織生長(zhǎng)量達(dá)到最大值，分別為18.07、20.03 g，顯著高于低質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)量。同樣，與兩高質(zhì)量濃度水平相比，低質(zhì)量濃度的MnSO4·4H2O 和CoCl2·6H2O 元素也會(huì)抑制愈傷組織生長(zhǎng)。

表3 微量元素處理對(duì)銀杏愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率及生長(zhǎng)量的影響

表4 微量元素處理組合對(duì)銀杏愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.2 不同微量元素質(zhì)量濃度組合對(duì)銀杏愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率及生長(zhǎng)量的影響

從表4可以看出，組合A3B4C2D1E3、A2B2C1D4E3、A3B1C3D4E2、A4B4C1D3E2和A1B3C3D3E3的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于其他組合，其中，A3B4C2D1E3的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到了96. 08%，而最低的A2B1C2D3E4僅為61.75%。從極差值R(表5)直觀分析可知，試驗(yàn)所考察的5 個(gè)因素中，Co 對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響最大，Cu 的影響最小。不同微量元素對(duì)銀杏愈傷組織誘導(dǎo)率的影響由大到小的順序?yàn)镃o、Mo、Mn、B、Cu。

愈傷組織褐化率最低的是A1B4C4D4E4，這個(gè)處理中并沒(méi)有觀察到褐化;而褐化率最高的是A3B1C3D4E2，達(dá) 到 了 24. 83%，然 而 與 處 理 A4B4C1D3E2、A4B3C2D4E1、A3B3C1D2E4、A2B3C4D1E2、A4B1C4D2E3間并不存在顯著差異(p ＜0.01)。從極差值R(表5)直觀分析可知，試驗(yàn)所考察的5 個(gè)因素中，Mo 對(duì)愈傷組織褐化的影響最大，Cu 的影響最小。不同元素對(duì)銀杏愈傷組織褐變的影響由大到小的順序?yàn)镸o、B、Co、Mn、Cu。

表5 極差分析

通過(guò)正交試驗(yàn)可以看出，愈傷組織生長(zhǎng)量最高的是A1B4C4D4E4，達(dá)到了24. 39 g，最低的是組合A1B1C1D1E1，僅為8.09 g，兩者相差達(dá)到了16.30 g，其差異極為顯著(p ＜0.01)。在所有處理中，處理組 合 A1B4C4D4E4、A2B2C1D4E3、A1B3C3D3E3和A4B3C2D4E1的愈傷組織生物量顯著高于其他處理，并達(dá)到了極顯著水平(p ＜0.01)。從極差值R(表5)直觀分析可知，試驗(yàn)所考察的5 個(gè)因素中，Cu 對(duì)愈傷組織鮮質(zhì)量的影響最大，Mo 的影響最小。不同元素對(duì)銀杏愈傷組織鮮質(zhì)量的影響由大到小的順序?yàn)镃u、B、Co、Mn、Mo。

3 結(jié)論與討論

植物愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中，受多種因素的影響。微量元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必不可少的營(yíng)養(yǎng)成分，在植物生理過(guò)程中起著非常重要的作用。硼能促進(jìn)生長(zhǎng)素的運(yùn)轉(zhuǎn)，提高植物的抗逆性;鉬能促近光合作用的強(qiáng)度以及活性鋁的毒害作用;銅催化植物的氧化還原反應(yīng)，與葉綠素形成有關(guān);錳提高植物的呼吸強(qiáng)度，是許多酶的活化劑，有利于蛋白質(zhì)的合成;鈷能改善生長(zhǎng)、蒸騰和光合作用，使葉綠素含量得以提高［8－9］。研究表明，不同微量元素對(duì)愈傷組織的影響各不相同。一般認(rèn)為過(guò)高的微量元素對(duì)愈傷組織存在毒害作用，而低質(zhì)量濃度的微量元素又阻礙愈傷組織生長(zhǎng)。只有適宜的微量元素組合能夠有效的促進(jìn)愈傷組織分化及生長(zhǎng)，降低愈傷組織褐化率，并增加組織中次生代謝產(chǎn)物。而這個(gè)值對(duì)不同植物來(lái)說(shuō)顯然存在一定差異。而也有研究認(rèn)為微量元素的差異對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響不大，對(duì)于褐化程度的控制有較為明顯的影響，隨著微量元素的質(zhì)量濃度升高，愈傷組織的褐化率先升后降［10］。微量元素對(duì)銀杏愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

從多重對(duì)比來(lái)看，銀杏愈傷組織誘導(dǎo)最佳的微量元素質(zhì)量濃度分別為:Na2MoO4·2H2O 1.250 mg·L－1、H3BO324.800 mg·L－1、MnSO4·4H2O 22.300 mg·L－1、CuSO4·5H2O 0. 500 mg·L－1、CoCl2·6H2O 0.125 mg·L－1;而銀杏愈傷組織生長(zhǎng)量最大的微量元素質(zhì)量濃度分別為Na2MoO4·2H2O 0.125 mg·L－1、H3BO324.800 mg·L－1、MnSO4·4H2O 44.600 mg·L－1、CuSO4·5H2O 0. 500 mg·L－1、CoCl2·6H2O 0.125 mg·L－1;褐化率最低的微量元素質(zhì)量濃度 分 別 為:Na2MoO4·2H2O 0. 125 mg·L－1、H3BO324.800 mg·L－1、MnSO4·4H2O 22.300 mg·L－1、CuSO4·5H2O 0.025 mg·L－1、CoCl2·6H2O 0.250 mg·L－1。但是，這些元素組合是否為最佳組合仍然有待進(jìn)一步研究。

而在本試驗(yàn)中，處理A3B4C2D1E3愈傷組織誘導(dǎo)率最高;愈傷組織褐化率最低，以及最有利于銀杏愈傷組織生長(zhǎng)的組合為A1B4C4D4E4。這也說(shuō)明了高質(zhì)量濃度的微量元素B、Mn、Cu、Co 組合能有效降低愈傷組織的褐化率。然而，之前的研究表明，培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度過(guò)高可引起酚類(lèi)分泌物大量產(chǎn)生，導(dǎo)致外植體褐變［10］，降低無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量濃度能有效地減少褐化的發(fā)生，降低褐化率［11－12］。本試驗(yàn)中，高質(zhì)量濃度的Na2MoO4·2H2O 的確增加愈傷組織褐化率，但是其他微量元素的增加反而降低了愈傷組織褐化，可能的原因在于培養(yǎng)基中這幾種微量元素的質(zhì)量濃度較低，其質(zhì)量濃度的變化對(duì)培養(yǎng)基總體無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度影響較小，不能有效地影響褐化現(xiàn)象，各處理對(duì)愈傷組織褐化的影響差異不明顯。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同類(lèi)型和水平的微量元素對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)影響達(dá)到極顯著水平，當(dāng)微量元素質(zhì)量濃度較低時(shí)，銀杏愈傷組織的生長(zhǎng)較差，鮮質(zhì)量較低。這是因?yàn)槲⒘吭刭|(zhì)量濃度較低時(shí)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)不足，從而影響愈傷組織的發(fā)育，降低了愈傷組織的生長(zhǎng)量。當(dāng)各微量元素質(zhì)量濃度增加時(shí)，愈傷組織的鮮質(zhì)量出現(xiàn)了不同程度的增加。這說(shuō)明，增加一定的微量元素質(zhì)量濃度，有利于愈傷組織的生長(zhǎng)。

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