楊明貴,王毓洪,李林章,王超,陸瑩瑩

(浙江寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所,315040)

葫蘆科植物未授粉子房培育單倍體研究進(jìn)展

楊明貴,王毓洪,李林章,王超,陸瑩瑩

(浙江寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所,315040)

綜述了近年來葫蘆科植物未授粉子房培養(yǎng)單倍體狀況,及葫蘆科植物未授粉子房培養(yǎng)的取材、基因型、溫度、激素等幾個(gè)因素影響的研究進(jìn)展,進(jìn)而對(duì)其當(dāng)前問題及前景進(jìn)行了探討。

葫蘆科；未授粉子房；單倍體

染色體加倍能快速純化單倍體植株育種材料,縮短育種年限,且使單倍體材料能在當(dāng)代即表現(xiàn)出顯隱性基因型性狀,在育種方面發(fā)揮著重要作用,在遺傳學(xué)研究及基因圖譜構(gòu)建等方面也具有重要的意義。葫蘆科(Cucurbitaceae)植物分布在中國的有130多個(gè)種,其中甜瓜、黃瓜、南瓜、葫蘆、西瓜等都具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,其品種改良具有極大潛力。在自然界中葫蘆科植物自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低[1],而長(zhǎng)期的研究結(jié)果表明,通過花藥和小孢子培養(yǎng)在葫蘆科植物中得到單倍體的幾率很小,但通過葫蘆科植物雌核發(fā)育(gynogenesis)途徑進(jìn)行單倍體研究是一條重要途徑。雌核發(fā)育是指離體條件下由未授粉胚囊產(chǎn)生單倍體胚和植株的過程[2]。雌核發(fā)育培育單倍體主要有2種方式:一種是讓精子入卵后,保證精核不與卵核融合而退化,刺激卵核分裂發(fā)育為胚,這種方式主要通過輻射處理花粉授粉后將雌核離體培養(yǎng)；另一種是對(duì)未授粉子房或胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng),誘導(dǎo)雌核發(fā)育。本文著重對(duì)未授粉子房培養(yǎng)研究狀況及影響因素作出簡(jiǎn)要概述。

1 葫蘆科植物雌花未授粉胚珠離體培養(yǎng)單倍體研究概況

未授粉胚珠離體培養(yǎng)是一種簡(jiǎn)單有效的加速植物快速純化的方法,而且為研究孤雌生殖或無配子生殖的細(xì)胞胚胎學(xué)提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系。

1985年,Chamboner等[3]首次在西葫蘆中采用未授粉胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)獲得單倍體和二倍體的植株。Metwally等[4,5]對(duì)西葫蘆品種Eskandarani開花前1 d的雌花,通過低溫誘導(dǎo)和含不同濃度2,4-D的MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),成功獲得了西葫蘆單倍體植株。隨后國內(nèi)學(xué)者陳學(xué)軍等[6]、謝冰等[7]分別在西葫蘆中得到胚囊植株并馴化成功。劉栓桃等[8]利用9個(gè)不同基因型的西葫蘆材料,研究了激素、取樣時(shí)間和基因型3個(gè)因素對(duì)西葫蘆未授粉胚珠離體培養(yǎng)的影響。南瓜子房未授粉子房培養(yǎng)試驗(yàn)1988年獲得初始成功[9]。Shalaby[10]在Metwally等[4]的基礎(chǔ)上采用1 mg/L 2,4-D和Kinetin培養(yǎng)基對(duì)基因型、雌

楊明貴（1978-）,男,博士,農(nóng)藝師,主要從事瓜菜遺傳育種與分子生物學(xué)研究, E-mail:yangmg722@163.com

黃瓜的未授粉子房離體培養(yǎng)研究始于1996年,但起始效果不佳[11]。Gémes等[12]將黃瓜子房放置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,在不同溫度下熱激并暗處理2～5 d,隨后轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明,熱激處理通過優(yōu)化雌配偶體發(fā)育提高雌核再生頻率。并通過組織觀察發(fā)現(xiàn)雌性配子體的單倍體誘導(dǎo)的最佳時(shí)期為胚囊形成階段。國內(nèi)隨后也對(duì)黃瓜基因型、取樣時(shí)期、激素及處理溫度對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)進(jìn)行了探討[13～16],并獲得了純合的黃瓜材料。

Ficcadenti等[17]首次在甜瓜中采用未授粉胚珠離體培養(yǎng)技術(shù),其選擇了2個(gè)常規(guī)材料和1個(gè)F1代雜交種進(jìn)行培養(yǎng)并獲得再生胚。隨后Lotfi等[18]也對(duì)甜瓜進(jìn)行了未授粉胚珠離體培養(yǎng)。Malik等[19]對(duì)不同溫度和幾種不同激素對(duì)甜瓜未授粉子房培養(yǎng)效果進(jìn)行研究,采用SSR分析證實(shí)獲得的雙單倍體植株為純合雙單倍體,并通過SSR標(biāo)記證實(shí)這些獲得的雙單倍體為純合的雌配子的再生胚。

以上這些研究結(jié)果表明,未授粉子房培養(yǎng)技術(shù)在葫蘆科植物育種及科學(xué)研究中的重要地位受到越來越多研究者的重視。而其復(fù)雜的影響因素對(duì)建立高效穩(wěn)定的技術(shù)體系有著嚴(yán)重阻礙,因此探討其最佳的培養(yǎng)條件對(duì)該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用有著重要意義。以下對(duì)其影響因素相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

2 未授粉葫蘆科植物胚胎發(fā)生影響因素

2.1 取材狀況

許多研究結(jié)果表明,試驗(yàn)材料的播種時(shí)期、雌花的發(fā)育時(shí)期及雌花的部位等對(duì)胚胎離體培養(yǎng)中的胚誘導(dǎo)頻率都有著重要的影響。陳學(xué)軍等[6]通過對(duì)西葫蘆開花前3 d,當(dāng)日和開花后2 d未授粉子房分別進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果顯示誘導(dǎo)率分別為10.5%, 14.2%和4.4%,表明開花當(dāng)日子房離體培養(yǎng)效率最高。謝冰等[7]通過西葫蘆不同開花時(shí)期取材試驗(yàn)證實(shí)開花前1 d和開花當(dāng)日胚珠誘導(dǎo)頻率最高,秋播材料誘導(dǎo)頻率較夏播和春播的高。Shalaby[10]對(duì)2個(gè)南瓜Giad和Raad的F1代的第一節(jié)雌花、第二節(jié)雌花和第三節(jié)雌花分別進(jìn)行未授粉胚珠離體培養(yǎng)研究后發(fā)現(xiàn),第二節(jié)雌花胚誘導(dǎo)和成苗效果最佳。劉栓桃等[8]對(duì)9種基因型西葫蘆材料進(jìn)行不同開花時(shí)期取材試驗(yàn),結(jié)果顯示,除1個(gè)材料沒能得到再生植株外,其他均表現(xiàn)為開花當(dāng)天的胚珠最適合誘導(dǎo)培養(yǎng),再生植株產(chǎn)率表現(xiàn)最高。

2.2 基因型

Ficcadenti等[17]對(duì)2個(gè)甜瓜品種(reticulatus, inodorus)及其雜交種進(jìn)行了未授粉雌花子房培養(yǎng),結(jié)果顯示,reticulatus出胚率最高。Shalaby[10]對(duì)12種不同基因型南瓜品種的未授粉雌花子房培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),Raad F1代材料表現(xiàn)最佳,胚誘導(dǎo)率為48.4%,每皿成苗15株。劉栓桃等[8]對(duì)9個(gè)不同基因型西葫蘆材料的未授粉胚珠誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),再生植株產(chǎn)率最高的能達(dá)到33.33%,而最低的僅為2.67%。陳小鵬等[14]對(duì)3個(gè)黃瓜品種未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果表明,黃瓜基因型對(duì)雌核發(fā)育也有著重要影響。以上這些結(jié)果表明,基因型在甜瓜、南瓜、西葫蘆等葫蘆科植物的雌核發(fā)育中有著重要作用。

2.3 溫度預(yù)處理

溫度處理極有可能促進(jìn)雌核發(fā)育由正常配子發(fā)育 (gametophytic development)轉(zhuǎn)換成腐生途徑(saprophytic pathway),從而導(dǎo)致單倍體胚形成[10]。Kwack等[9]研究表明,南瓜在5℃條件下預(yù)處理2 d能提高胚胎的發(fā)生幾率。Gémes等[12]將黃瓜子房放

置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (induction media containing thidiazuron)上,分別在24,28,35℃環(huán)境下暗處理2～5 d；隨后轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(regeneration media αnaphthaleneacetic acid and 6-benzylaminopurine),結(jié)果表明,熱激處理通過優(yōu)化雌配偶體發(fā)育提高雌核再生頻率。其中35℃胚胎再生效果最好,其胚胎發(fā)生頻率為18.4%,植株再生頻率為7.1%。Shalaby[10]將南瓜Queen F1代分別放置在4℃和32℃下預(yù)處理0,4,7,12 d,結(jié)果顯示,4℃或32℃條件下都是4 d的處理效果最佳。Diao等[16]對(duì)黃瓜的研究結(jié)果也表明,在35℃條件下熱激3 d的效果較2 d和4 d的好。

此外在對(duì)葫蘆科植物子房進(jìn)行溫度刺激預(yù)處理的試驗(yàn)中,也有些結(jié)果表明,熱激或冷激處理對(duì)雌核誘導(dǎo)成單倍體有副作用。Yang等[20]的研究結(jié)果表明,許多物種中冷激處理對(duì)雌核培養(yǎng)具有副作用。Metwally等[4]通過將開花前1 d的西葫蘆(Eskandarani)在4℃分別進(jìn)行2,4,8 d預(yù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不進(jìn)行預(yù)處理的的材料具有最高的胚誘導(dǎo)率。

2.4 激素處理

Kwack等[9]研究認(rèn)為,植物激素對(duì)南瓜的胚發(fā)生有著重要作用。Metwally等[4]在誘導(dǎo)西葫蘆未授粉胚胎分化時(shí)分別使用濃度為0.1,1,5,10 mg/L的2,4-D,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 mg/L和5 mg/L 2,4-D處理的胚誘導(dǎo)率較高。Malik等[19]在進(jìn)行甜瓜未授粉子房培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn),0.04 mg/L和0.02 mg/L的TDZ在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中顯著增加胚珠愈傷產(chǎn)生,胚誘導(dǎo)率分別為46.6%和65.83%,而濃度為0.6 mg/L的6-BA激素顯著提高外植體再生率。

Diao等[16]認(rèn)為,TDZ能促進(jìn)胚胎形成,以0.04 mg/L的TDZ效果最佳。而將AgNO3加到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中對(duì)胚的誘導(dǎo)并沒有顯著影響,但會(huì)縮短胚胎萌芽期和提高胚胎形成數(shù)目,其選用的材料之間出胚率并無顯著差異。謝冰等[7]將西葫蘆未授粉胚珠接種至含不同濃度2,4-D,NAA,BA的N6培養(yǎng)基上,結(jié)果發(fā)現(xiàn),2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA+ 1 mg/L BA培養(yǎng)基上的胚狀體誘導(dǎo)頻率最高。劉栓桃等[8]通過對(duì)4個(gè)西葫蘆品種研究結(jié)果表明,在濃度為0.5 mg/L NAA和1.0 mg/L的2,4-D的培養(yǎng)基上再生植株產(chǎn)率最高,達(dá)28.33%。

2.5 瓊脂和蔗糖濃度

陳學(xué)軍等[6]發(fā)現(xiàn),西葫蘆胚珠愈傷組織誘導(dǎo)成苗階段,蔗糖濃度為20 g/L的培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率最高,為15.6%。Shalaby[10]在南瓜Eskandrani胚珠誘導(dǎo)時(shí)使用30,60,90 g/L的蔗糖濃度梯度比較發(fā)現(xiàn),蔗糖濃度為30 g/L時(shí),胚珠誘導(dǎo)效率最佳,而蔗糖濃度為90 g/L時(shí),胚珠完全不能生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明,在愈傷組織芽分化時(shí)可能需要較低的滲透壓。

此外,AgNO3是乙烯合成的抑制劑,Mohiuddin等[21]認(rèn)為,AgNO3影響愈傷組織的內(nèi)源激素代謝從而有利于葫蘆科植物植株的再生。陳學(xué)軍等[6]研究發(fā)現(xiàn)NO3-有利于不定根的形成。韓麗華等[22]將甜瓜胚珠用不同濃度的硝酸銀進(jìn)行處理,結(jié)果顯示在硝酸銀濃度為80 mg/L時(shí)出胚率最高,為0.74%。

3 未授粉子房培養(yǎng)展望

葫蘆科植物具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,通過單倍體離體誘導(dǎo)技術(shù)對(duì)葫蘆科植物的品質(zhì)、抗逆性、抗病害能力等進(jìn)行改良,將會(huì)在葫蘆科植物的遺傳育種中開拓一條嶄新的途徑。自從20世紀(jì)60年代利用未授粉子房培養(yǎng)單倍體獲得成功以來[23],自然界植物的單倍體育種技術(shù)也取得長(zhǎng)足的進(jìn)步。通過未授粉子房培養(yǎng)單倍體的技術(shù)快速純化葫蘆科植物基因型,加快育種進(jìn)度在葫蘆科植物育種中具有重要意義。當(dāng)前通過未授粉子房培養(yǎng)單倍體的方式在育種中已經(jīng)取得了一些進(jìn)步,但是當(dāng)前葫蘆科植物未授粉胚珠離體培養(yǎng)的過程中仍存在許多復(fù)雜的影響因素導(dǎo)致其誘導(dǎo)率、成胚率、成苗率較低等。因此通過改進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)來提高誘導(dǎo)效率,建立穩(wěn)定性好,重復(fù)性高的未授粉子房離體培養(yǎng)技術(shù)在葫蘆科植物育種中具有重要意義。

[1]Savin F,Decomble V,Le Couviour M,et al.The X-ray detection of haploid embryos arisen in muskmelonL.seeds,and resulting from a parthenogenetic development induced by irradiated,pollen [J].Cucurbit Genetic Cooperative Report,1988,11:39-42.

[2]San Noeum L H.In vitro induction of gynogensis in higher plants[M].Wageniegen:Proceedings of the Conference on Broadening Genetic Base of Crops,1979:327-329.

[3]Chambonner D,Dumas de Vaulx R.Obtention of embryos and plants from in vitro culture of unfertilizered ovules ofCucurbit Genet Coop Rpt,1986,8:66.

[4]Metwally E I,Moustafa S A,EI-Sawy B I, er al. Production of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of[J].Plant Cell,Tiss Org Cult,1998,53:117-121.

[5]Metwally E I,Moustafa S A,EI-Sawy B I,et al.Haploid plantlets derived by anther culture ofPlant Cell,Tiss Org Cult,1998,52:171-176.

[6]陳學(xué)軍,邢國明,陳竹君.西葫蘆未授粉胚珠離體培養(yǎng)和植株再生[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2000,12(3):165-167.

[7]謝冰,王秀峰,樊治成.西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及胚囊植株的產(chǎn)生[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,39 (1):132-138.

[8]劉栓桃,趙智中,孫小鐳,等.西葫蘆未受精胚珠離體誘導(dǎo)植株再生的關(guān)鍵因素[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(2):96-100.

[9]Kwack S N,Fujieda K.Somatic embryogenesis in cultured unfertilized ovules ofJ Jpn Soc Hort Sc,1988,57:34-42.

[10]Shalaby T A.Factors affecting haploid induction through in vitro gynogenesis in summer squash[J].Scientia Horticulturae,2007,115(1):1-6.

[11]Gémes Juhász A,Venczel G,Balogh P.Haploid plant induction in zucchiniDuch)and in cucumberlines through in vitro gynogenesis[J].Acta Hortic,1996, 447:623-625.

[12]Gémes Juhász A,Balogh P,Ferenczy A,et al.Effect of optimal stage of female gametophyte and heat treatment on in vitro gynogenesis induction in cucumberL.)[J].Plant Cell Rep,2002,21(2):105-111.

[13]杜勝利,韓毅科,魏愛民,等.黃瓜倍性鑒定方法的研究[J].園藝學(xué)報(bào),2002(29):280-281.

[14]陳小鵬,劉栓桃,孫小鐳,等.黃瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)研究初報(bào)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,14(2):148-151.

[15]韓毅科,杜勝利,魏愛民,等.利用未受精子房培養(yǎng)技術(shù)育成黃瓜新品種‘津美3號(hào)’[J].園藝學(xué)報(bào),2010,37(3): 509-510.

[16]Diao W,Jia Y,Song H,et al.Efficient embryo induction in cucumber ovary culture and homozygous identification oftheregenetantsusing SSR markers [J].Scientia Horticulturae,2009,119:246-251.

[17]Ficcadenti N,Sestili S,Annibali S,et al.In vitro gynogenesis to induce haploid plants in melonJournal of Genetics and Breeding,1999,53(3): 255-257.

[18]Lotfi M,Alan A R,Henning M J,et al.Production of haploid and doubled haploid plants of melonfor use in breeding for multiple virus resistance [J].Plant Cell Rep,2003,21(11):1 121-1 128.

[19]Malik A A,Cui L,Zhang S,et al.Efficiency of SSR makers for determining the origin of melon plantlets derived through unfertilized ovary culture[J].Hort Sci, 2011,38(1):27-34.

[20]Yang HY and Zhou C.In vitro induction of haploid plants from unpollinated ovaries and ovules[J].Theor Appl Genet,1982,63:97-104.

[21]Mohiuddin A K M,Choedhury M K U,Abdullah Z C,et al.Influence of silver nitrate (ethylene inhibitor)on cucumber in vitro shoot regeneration[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1997,51:75-78.

[22]韓麗華,王建設(shè),陳貴林.AgNO3對(duì)甜瓜離體胚囊的影響[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28(2):48-50.

[23]Maheshwari N.In vitro culture of excised ovules of L.[J].Phytomorphology,1961,11: 307-314.

Research Progress on Obtaining Cucurbitaceous Haploid through Un-pollinated Ovary Culture

In this paper,we summarized the recent research progresses on obtaining cucurbitaceous haploid through unpollinated ovary culture,and analyzed the factors affecting the culture,such as the stage of explants,genotype, temperature pretreatments,auxin and so on.And we also discussed the existing problems and prospects of adopting the un-pollinated ovary culture method to obtain cucurbitaceous haploid.

Cucurbitaceae；Un-pollinated ovaries；Haploid

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.02.003

2012-12-14花位置、溫度和蔗糖濃度4個(gè)因素進(jìn)行研究并獲得了南瓜單倍體植株。