李趣嫦 鐘燕飛 肖建光 茍 強

廣東省食品藥品檢驗所微生物室，廣東 廣州 510180

薔薇科中藥配方顆粒微生物限度檢查法方法學研究

李趣嫦 鐘燕飛 肖建光 茍 強

廣東省食品藥品檢驗所微生物室，廣東 廣州 510180

目的：建立薔薇科8種代表性中藥 （山楂、苦杏仁、桃仁、地榆、枇杷葉、木瓜、烏梅和金櫻子）配方顆粒微生物限度檢查法，并進行方法學驗證。方法：采用平皿法和培養(yǎng)基稀釋法。結果：其中5種 （山楂、苦杏仁、桃仁、木瓜和烏梅）中藥配方顆?？刹捎闷矫蠓ㄟM行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)檢查；另外3種 （地榆、枇杷葉和金櫻子）可用培養(yǎng)基稀釋法進行細菌計數(shù)、霉菌及酵母菌計數(shù)檢查；控制菌均可用常規(guī)法檢查。結論：薔薇科中藥配方顆粒多數(shù)無抑菌性，少數(shù)對個別菌譜的微生物有一定的抑菌性。

薔薇科中藥；配方顆粒；微生物限度；方法學驗證

薔薇科（Rosa multiflora）植物主要分布在北半球溫帶、亞熱帶及熱帶山區(qū)等地區(qū)，多種薔薇科植物被2010年版《中國藥典》藥典收錄［1］，常見的代表性薔薇科中藥有山楂、苦杏仁、桃仁、地榆、枇杷葉、木瓜、烏梅和金櫻子等，這些薔薇科中藥在化學成分、藥理及藥效方面的研究非常廣泛［2－9］，并有多種常見中藥劑型，如單味的配方顆粒等。薔薇科中藥及制劑的微生物限度檢測方法尚未見正式文獻報道，2010年版 《中國藥典》一部［1］要求，口服制劑應做微生物限度檢查，并應對所用方法進行驗證，以確定所采用的方法適合于該產品的微生物限度檢查，保證能充分檢出供試品中污染的微生物。本文建立了薔薇科中8種代表性中藥 （山楂、苦杏仁、桃仁、地榆、枇杷葉、木瓜、烏梅和金櫻子）配方顆粒的微生物限度檢查方法，采用5種標準菌株 （大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉），人工污染8種代表性的薔薇科中藥配方顆粒，并對各試驗菌進行回收率試驗，建立其微生物限度的檢查方法，同時對方法學進行驗證，為本薔薇科中藥材的抑菌性作科學研究，對其相應品種的微生物限度檢查法的建立作有效的技術支撐。

1 儀器與試藥

1.1 菌種 金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］和白色念珠菌［CMCC（F）10123］均購自中國藥品生物制品檢定所；黑曲霉（ATCC16404）購自于廣東省微生物研究所。

1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基，曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 供試品

華潤三九醫(yī)藥股份有限公司苦杏仁配方顆粒 1007021S、1006281S、1006261S 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司桃仁配方顆粒 1006171S、1006131S、1006091S 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司地榆配方顆粒 1007221S、1007291S、1007261S 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司枇杷葉配方顆粒 1004281Z、1004271Z、1004231Z 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司木瓜配方顆粒 1203023、1203022、1111044 廣東一方制藥有限公司烏梅配方顆粒 1106100、1112046、1106101 廣東一方制藥有限公司金櫻子配方顆粒 1111110、1111111、1108068生產廠家山楂配方顆粒 1111071S、1111081S、1111091S供試品名稱 批號廣東一方制藥有限公司

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

2.1.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 取新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24小時；培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。用于控制菌驗證時配制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。

2.1.2 白色念珠菌 取新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)24～48小時；培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。

2.1.3 黑曲霉 取新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。

2.2 供試液的制備 取樣品10g，加入pH7.0的氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100m l，搖勻，制成1∶10供試液。

2.3 驗證試驗

2.3.1 試驗組

2.3.1.1 平皿法 各取1∶10供試液1ml和試驗菌液1ml，分別注入平皿中，立即傾注相應瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.3.1.2 培養(yǎng)基稀釋法 各取1∶10供試液0.5ml、0.2ml、0.1ml和試驗菌液1ml，分別注入平皿中，立即傾注相應瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.3.2 菌液組 取試驗菌液1ml注入平皿中，立即傾注相應瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數(shù)。

2.3.3 供試品對照組 各取1∶10供試液1ml、0.5m l、0.2m l、0.1m l，按試驗組操作，不加菌液，測定樣品本底菌。

2.4 回收率試驗

2.4.1 平皿法測定 薔薇科8種中毒顆粒劑平皿法測定的回收率結果見表1。由表1可見，山楂、苦杏仁、桃仁、木瓜和烏梅5種供試品的5種菌株的回收率均高于70%，可采用平皿法進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)。地榆的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌回收率低于70%，說明本品對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有抑菌作用，細菌、霉菌及酵母菌檢查不能采用平皿法檢查。枇杷葉的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率低于70%，說明本品對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，細菌檢查不能用平皿法，而白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，可采用平皿法進行霉菌及酵母菌計數(shù)。金櫻子的金黃色葡萄球菌回收率低于70%，說明本品對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，細菌檢查不能用平皿法，而白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，可采用平皿法進行霉菌及酵母菌計數(shù)。

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法測定 枇杷葉和金櫻子培養(yǎng)基稀釋法測定的回收率結果見表2，地榆培養(yǎng)基稀釋法測定的結果見表3。由表2可見，枇杷葉和金櫻子采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5m l/皿）時，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%，可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5m l/皿）進行細菌計數(shù)。由表3可見，地榆采用培養(yǎng)基稀釋法（0.1m l/皿）時，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%，可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.1m l/皿）進行細菌計數(shù)檢查；采用培養(yǎng)基稀釋法 （0.2m l/皿）時，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2m l/皿）進行霉菌及酵母菌計數(shù)。

表1 薔薇科8種中藥顆粒劑平皿法的回收率 （%）

表2 枇杷葉和金櫻子培養(yǎng)基稀釋法的回收率 （%）

表3 地榆培養(yǎng)基稀釋法的回收率 （%）

2.5 控制菌檢查法的驗證 配方顆粒作為口服制劑，按照《中國藥典》2010年版［1］要求，微生物限度檢查法還包括了控制菌大腸埃希菌的檢查。

2.5.1 大腸埃希菌檢查法的驗證 取1∶10的供試液10m l及1m l大腸埃希菌菌液加至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，按大腸埃希菌的檢查法進行驗證，結果見表4。由表4可見，所有供試品均可用常規(guī)法檢查大腸埃希菌。

Development and Validation of a Microbial Limit Detection Method for Chinese formula Granules of Rosebus

Li Qu－chang，Zhong－Yan－fei，Xiao Jian－guang，Gou Qiang，Lin Li－ying
Guangdong Institute for Food and Drug Control，Guangzhou 510180，China

Objective：To develop and validate a method for microbial limit detection of 8 kinds of Chinese formula granules of Rosebush，i.e.hawthorn fruit，armeniaca amara，peach kernel，great burnet，folium eriobotryae，pawpaw，smoked plum and fructus rosae laevigatae.Methods：Routine method and culture medium diluted method were used in this study.Results：The bacteria，mold and yeast were counted by routine method for five kind of the Chinese formula granules（hawthorn fruit，armeniaca amara，peach kernel，pawpaw and smoked plum）and culture medium diluted method for three kind of other Chinese formula granules（great burnet，folium eriobotryae and fructus rosae laevigatae）；Control of bacteria were checked by routine test.Conclusion：Most species of the Chinese formula granules of Rosebush have not antibacterial activity while a few of them have certain inhibition on individual pathogens microorganism.

Rosebush；granules；microbial limit detection；method validation

R282.71

A

1007－8517（2013）09－0028－03

李趣嫦（1982－）女，學士，藥師，研究方向：藥物分析。E－mail：liquchang＠sohu.com。