朱祖成

湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000

丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞
TGF－β1及Smad4表達(dá)的影響

朱祖成

湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000

目的：研究丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激致人源肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cell，HSC）LX2增殖及TGF－β1、Smad4和Collagen ImRNA表達(dá)的影響。方法：在建立體外過(guò)氧化氫（H2O2）致HSC－LX2細(xì)胞氧應(yīng)激模型基礎(chǔ)上，用MTT法檢測(cè)丹皮酚對(duì)HSC－LX2細(xì)胞增殖的影響，生化檢測(cè)HSC－LX2細(xì)胞內(nèi)MDA及SOD，熒光定量PCR檢測(cè)丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞TGF－β1、Smad4和Collagen I mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：丹皮酚呈劑量依賴性抑制H2O2誘導(dǎo)HSC－LX2增殖，抑制細(xì)胞MDA含量及增加SOD活性，以50μmol/L濃度時(shí)最為明顯，與DMSO組比較差異有顯著性（P＜0.01）；丹皮酚各劑量組作用24 h后，HSC－LX2細(xì)胞中TGF－β1、Smad4和Collagen I mRNA的水平降低，與DMSO組比較（P＜0.01），且作用呈劑量依賴性。結(jié)論：丹皮酚預(yù)處理肝星狀細(xì)胞可下調(diào)TGF－β1、Smad4mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞Collagen I的合成，發(fā)揮抗肝纖維化作用。

丹皮酚；過(guò)氧化氫；人肝星狀細(xì)胞；肝纖維化

丹皮酚（Paeonol）又稱牡丹酚，分離自中藥牡丹、芍藥的干燥根皮和徐長(zhǎng)卿的根或全草，具有較廣藥理作用，且具有抗過(guò)敏與抗炎、抗心肌缺血再灌注損傷、抗神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激損傷、抗腫瘤作用等作用［1，2］。近年研究表明丹皮酚顯著抑制乙醇灌胃大鼠的酒精性肝損害，降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平、減少肝細(xì)胞脂肪變性和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及肝細(xì)胞的凋亡，有較好的護(hù)肝作用［3］。為進(jìn)一步研究其藥理作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在建立體外過(guò)氧化氫（H2O2）致人源性肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cell，HSC）LX2細(xì)胞系氧應(yīng)激的基礎(chǔ)上，觀察丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激HSC－LX2細(xì)胞增殖及TGF－β1、Smad4和Collagen ImRNA表達(dá)的影響，探討丹皮酚抗肝纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人源性肝星狀細(xì)胞系HSC－LX2，購(gòu)于江蘇博慧斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物及試劑 丹皮酚（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度為98%，批號(hào)111532－201005）；30%H2O2（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)H3410）；MTT（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)M2128）；Prime-Script RT reagent Kit，SYBR Premix Ex TaqTM（日本Takara公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）。

1.3 主要儀器 ABI7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）Thermo Scientific Series 8000二氧化碳培養(yǎng)箱、Thermo Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；DU640紫外分光核酸蛋白分析儀（美國(guó)BECKMAN公司）；SW－CJ－2FD型超凈化工作臺(tái)（蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HSC－LX2細(xì)胞置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，每3d傳代一次，每次試驗(yàn)均在呈指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行。

2.2 藥品配制 將丹皮酚33.2mg溶于5mL 50%DMSO，得到濃度為20mmol/L的母液，0.22μm的濾頭過(guò)濾后置于－20℃儲(chǔ)存。臨用時(shí)用完全培養(yǎng)基配制成為濃度為1.0mmol/L的工作液。

2.3 細(xì)胞模型 分別取待傳代的HSC－LX2用10%FBSDMEM培養(yǎng)基稀釋成1×105個(gè)/ml或5×105個(gè)/ml密度接種到96孔板或6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合約70%左右，換為含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化，培養(yǎng)細(xì)胞用PBS洗3遍，用終濃度為0.1mmol/LH2O2共同孵育2h，用PBS洗3遍，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 細(xì)胞分組 隨機(jī)分6組，①空白對(duì)照組：加入含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h；②DMSO組，含0.1%DMSO的1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h；③H2O2模型組：含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液加入0.1mmol/LH2O2共同孵育2h，培養(yǎng)24h；④～⑥低、中、高劑量丹皮酚組：用終濃度為0.1mmol/LH2O2共同孵育2 h，加入終濃度分別為0.5、5和50μmol/L丹皮酚，共同培養(yǎng)24h，進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 MTT法測(cè)定丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞融合約70%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，換含1% 的DMEM培養(yǎng)24h后，用終濃度為0.1mmol/l H2O2共同孵育2 h，更換為用1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的終濃度為0.5、5和50μmol/L丹皮酚，共同培養(yǎng)24h后，各組每孔加入5mg·ml－1的MTT溶液20μl，孵育4h，每孔加入150μl DMSO，振蕩10分鐘，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各組在490 nm波長(zhǎng)光吸收值（OD值）。設(shè)不加細(xì)胞只加孵育液的空白對(duì)照。以溶媒DMSO組為對(duì)照孔，取各組8孔平均OD值計(jì)算抑制率，抑制率＝（對(duì)照孔A490－實(shí)驗(yàn)孔A490）/對(duì)照孔×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2.6 生化檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用南京建成生物工程研究所試劑盒分別測(cè)量各組MDA、SOD的活性。

2.7 熒光定量PCR法檢測(cè)TGF－β1、Smad4和Collagen I mRNA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用TRIzol法抽提細(xì)胞中總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA含量及純度，A260/A280均在1.8～2.0之間。取cDNA5μg，采用M－MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)GenBank查找基因序列并自行設(shè)計(jì)引物，GAPDH上游引物5′－GGATTTGGTCGTATTGGG－3′，GAPDH下游引物5′－GGAAGATGGTGAT GGGA TT－3′；Collagen I上游引物5′－CCCGGGTTTCAGAGACAACTTC－3′，Collagen I下游引物5′－TCCACATGCTTTATTCCAGCAATC－3′，TGF－β1上游引物5′－GCGACTCGCCAGAGTGGTTA－3′，TGF－β1下游引物5′－GTTGATGTCCACTTGCAGTGTGTTA－3′，Smad4上游引物5′－CAGCACTACCA CCTGGACTGGA－3′，Smad4下游引物5′－CTGGAATGCAAG CTCATTGTGAA－3′，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30sec，5℃變性5sec，60℃退火30s，72℃延伸1min，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用ABI 7500數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)每個(gè)樣品的熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析并得到Ct值。參考文獻(xiàn)［4］采用2－ΔΔCt方法對(duì)TGF－β1及Smad4基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量，GAPDH為內(nèi)參，以DMSO組為對(duì)照組并設(shè)為基礎(chǔ)表達(dá)，計(jì)算出各組mRNA相對(duì)表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

3 結(jié)果

3.1 丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞增殖的影響 DMSO組與空白組對(duì)HSC－LX2無(wú)明顯抑制作用，與DMSO組比，H2O2模型組可促使HSC－LX2細(xì)胞增殖37.7%，而丹皮酚呈劑量依賴性抑制HSC－LX2細(xì)胞增殖，抑制率分別為23.5%、41.0%和67.5%，以50μmol/L濃度時(shí)最為明顯，與H2O2模型組比較差異有顯著性（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝8）

表1 丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝8）

注：與DMSO組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與H2O2模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

/100%空白組組別 劑量（μmol·L－1） OD 抑制率0 50 0.312±0.036＃＃ 67.5 0.961±0.093 －DMSO組 0 0.959±0.091 －H2O2模型組 0 1.352±0.115**－37.7%丹皮酚低劑量組 0.5 0.734±0.072＃ 23.5丹皮酚中劑量組 5 0.531±0.057＃＃ 41.0丹皮酚高劑量組

3.2 丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞MDA及SOD的影響 DMSO組與空白組對(duì)HSC－LX2細(xì)胞MDA及SOD無(wú)明顯影響，與DMSO組比，H2O2模型組可促使HSC－LX2細(xì)胞MDA升高約4.3倍，而SOD下降約87%，與H2O2模型組比，丹皮酚呈劑量依賴性使MDA下降，而SOD呈劑量依賴性升高，以50μmol/L濃度時(shí)最為明顯，與H2O2模型組比較差異有顯著性（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 各組對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞MDA及SOD的影響（±s，n＝8）

表2 各組對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞MDA及SOD的影響（±s，n＝8）

注：與DMSO組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與H2O2模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別 劑量（μmol/L）MDA（umol/L） SOD（IU/L）0.13±0.02 87.25±10.89 DMSO組 0 0.15±0.03 88.31±10.13 H2O2模型組 0 0.79±0.07**11.76±1.63**丹皮酚低劑量組 0.5 0.54±0.05＃ 28.37±2.15＃＃丹皮酚中劑量組 5 0.39±0.04＃＃ 41.78±4.53＃＃丹皮酚高劑量組空白組0 50 0.22±0.03＃＃57.67±5.78＃＃

3.3 丹皮酚對(duì)氧應(yīng)激致HSC－LX2細(xì)胞TGF－β1、Smad4和Collagen ImRNA表達(dá)影響 采用2－ΔΔCt方法的公式進(jìn)行計(jì)算，得到相對(duì)于DMSO組TGF－β1、Smad4和Collagen I的mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：DMSO組有一定量TGF－β1、Smad4和Collagen I的mRNA表達(dá)，而與DMSO組比，H2O2模型組可誘導(dǎo)這三種基因顯著升高（P＜0. 01）；經(jīng)丹皮酚作用24 h后，HSC－LX2細(xì)胞TGF－β1、Smad4和Collagen I的mRNA含量較DMSO組均下降（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 丹皮酚對(duì)HSC－LX2細(xì)胞α－SMA和Collagen I的mRNA表達(dá)影響（±s，n＝6）

表3 丹皮酚對(duì)HSC－LX2細(xì)胞α－SMA和Collagen I的mRNA表達(dá)影響（±s，n＝6）

注：與DMSO組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與H2O2模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

Smad4 Collagen I空白組組別 劑量（μmol·L－1） TGF－β1 0 50 0.52±0.01＃＃ 0.43±0.03＃＃ 0.31±0.02＃＃0.99±0.15 0.99±0.12 1.00±0.09 DMSO組 0 1.00±0.14 1.00±0.13 1.00±0.08 H2O2模型組 0 1.37±0.13** 1.64±0.15** 2.01±0.11**丹皮酚低劑量組 0.5 0.96±0.03＃＃ 0.89±0.09＃＃ 0.79±0.05＃＃丹皮酚中劑量組 5 0.71±0.07＃＃ 0.61±0.07＃＃ 0.50±0.03＃＃丹皮酚高劑量組

4 討論

目前肝纖維化的形成仍然不清楚，近年來(lái)研究表明肝星狀細(xì)胞在肝纖維化過(guò)程中起中心環(huán)節(jié)的作用，在各種損肝因子引起肝細(xì)胞損傷、氧自由基、壞死、凋亡及肝組織炎癥反應(yīng)等刺激下，HSC被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，發(fā)生表型及功能改變，并表達(dá)α－SMA，繼而使肝臟細(xì)胞外膠原和蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)生成增加而降解減少，最終導(dǎo)致肝臟膠原沉積與纖維化［5］。在肝纖維化形成過(guò)程中氧自由基及其引起的脂質(zhì)過(guò)氧化具有重要作用。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物可直接激活肝星狀細(xì)胞，介導(dǎo)HSC的分化、增殖和膠原合成，抗氧化劑能夠抑制HSC的活化、增殖和膠原的沉積，已證明H2O2引起的肝纖維化與脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)［6］，本實(shí)驗(yàn)用H2O2與HSC在體外共同培養(yǎng)，誘導(dǎo)氧應(yīng)激，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖，是較理想的肝纖維化的模型。丹皮酚呈劑量依賴性依賴性抑制HSC－LX2細(xì)胞增殖，使肝星狀細(xì)胞內(nèi)MDA下降，而使肝星狀細(xì)胞內(nèi)SOD呈劑量依賴性升高，以50μmol/L濃度時(shí)最為明顯。以往的研究表明丹皮酚具有抗神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激損傷［7］，以上結(jié)果提示丹皮酚抗肝纖維化作用機(jī)制之一可能與其能抑制HSC的增殖，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

肝星狀細(xì)胞活化中，TGF－β是肝內(nèi)最強(qiáng)的誘導(dǎo)纖維化發(fā)生的細(xì)胞因子之一，TGF－β1是TGF－β家族中調(diào)節(jié)效應(yīng)最為顯著的成員，也是目前在各種生理、病理過(guò)程中研究最為廣泛的TGF－β［5］。肝損傷時(shí)HSC、枯否細(xì)胞及其他細(xì)胞通過(guò)自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生大量的TGF－β，激活的TGFβ，通過(guò)與細(xì)胞膜上的Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合激活Smads蛋白并形成復(fù)合物，由此轉(zhuǎn)入核內(nèi)與各種轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［8］。研究表明Smads蛋白是目前所知的唯一的I型受體胞內(nèi)激酶的底物。Smads蛋白介導(dǎo)了TGF的－胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前已知至少9種Smads蛋白，分為3類：受體依賴性Smad蛋白（Smadl/Smad2/Smad3/Smad8等）；其介質(zhì)性Smad蛋（Smad4）；抑制性Smad蛋白（Smad6/Smad7）。Smads介導(dǎo)TGF－β超家族受體到核基因的信號(hào)傳遞，smad4為其通用型smad蛋白，為T(mén)GF－β信號(hào)傳導(dǎo)通路所必須的下游中介分子，TGF－B信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)肝纖維化的形成和發(fā)展有十分重要的作用［9］。本研究運(yùn)用一種可信、準(zhǔn)確而相對(duì)經(jīng)濟(jì)的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了丹皮酚對(duì)人肝星狀細(xì)胞中TGF－β1及Smad4的mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以不同濃度的丹皮酚孵育24h后，能顯著抑制HSC－LX2內(nèi)TGF－β1及Smad4的mRNA表達(dá)，呈現(xiàn)劑量依賴性，進(jìn)而抑制Collagen I。表明明丹皮酚抗肝纖維化作用機(jī)制之一是從mRNA水平抑制TGF－β1/Smad4通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞外基質(zhì)如Collagen I等發(fā)揮抗肝纖維化作用。

5 結(jié)論

丹皮酚預(yù)處理肝星狀細(xì)胞可下調(diào) TGF－β1、Smad4mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞Collagen I的合成，發(fā)揮抗肝纖維化作用。

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Effects of paeonol on expression of TGF－β1 and Smad4 in human hepatic stellate cells activated by Oxidative Stress

ZHU Zu－cheng
Medical School of Hubei University for Nationalities，Enshi445000，China

Aim：To investigate the effect of paeonol on the expression of TGF－β1，Smad4 and Collagen ImRNAinhuman hepatic stellate cells（HSC－LX2）activated by H2O2.M ethods：HSC－HSC－LX2 were cultured in vitro，stimulated by H2O2for 2 hours and treated with different concentrations of paeonol for24 hours，MTT assay was used to evaluate the inhibitive effectof paeonol. The expressions of TGF－β1，Smad4 and Collagen ImRNA were determined by Real－time quantitative PCR.ResultsDifferent concentration of paeonol inhibited the activation and proliferation of HSC－LX2，in a dose dependentmanner.The inhibitive effect was most obvious in 50μmol/L.he expressions of TGF－β1，Smad4 and Collagen Iweremarkedly reduced by the treatment with three concentrations of plumbago than that in the leptin group，and was dose dependent.ConclusionThe expressions of TGF－β1，Smad4 can be down－regulated by paeonol，resulting in the reduced synthesis of Collagen I，which may be one of the possible molecular mechanism against hepatic fibrosis.

paeonol；H2O2；human hepatic stellate cells；hepatic fibrosis

R289

A

1007－8517（2013）05－0022－03

2013.01.12）