肖作淼，余路虎，李志紅，李文華，李江環(huán)，陳先春，唐金鳳，肖九長

(贛州市人民醫(yī)院檢驗科,江西贛州341000)

簡易“PNH三項”檢查對貧血類型鑒別的應(yīng)用

肖作淼，余路虎，李志紅，李文華，李江環(huán)，陳先春，唐金鳳，肖九長

(贛州市人民醫(yī)院檢驗科,江西贛州341000)

目的研究簡化的酸溶血試驗、蔗糖溶血試驗和尿含鐵血黃素試驗即PNH三項聯(lián)合應(yīng)用對陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)的檢出效果。方法對4例PNH、3例AA-PNH綜合征患者、106例其他貧血患者及20例正常對照者進行簡易PNH三項試驗，并統(tǒng)計各項試驗在疾病中的陽性檢出率。結(jié)果4例PNH和3例AAPNH患者PNH三項試驗均為陽性，其他貧血患者中，酸溶血試驗均為陰性，而蔗糖血和尿含鐵血黃素試驗單項目有不同程度的檢出。結(jié)論簡易PNH三項聯(lián)合檢查對PNH和AA-PNH有良好檢出率且特異性強，但操作過程比傳統(tǒng)方法更加簡便易行，值得基層實驗室推廣。

酸溶血試驗；蔗糖水溶血試驗；尿含鐵血黃素；陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)是一種后天獲得的造血干細(xì)胞基因突變的克隆性疾病，臨床主要表現(xiàn)有血管內(nèi)溶血、靜脈栓塞形成、骨髓造血功能衰竭等[1]。酸溶血試驗(即Ham試驗)、蔗糖溶血試驗和尿含鐵血黃素(即Rous試驗)三個檢驗項目，簡稱PNH三項，是針對陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)診斷的檢驗項目。為觀察PNH三項檢查對不同貧血疾病的鑒別診斷意義，我們對PNH、再生障礙性貧血(AA)-PNH綜合征，缺鐵性貧血(IDA)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)缺乏癥、骨髓增生異常綜合征(MDS)、巨幼細(xì)胞性貧血(MA)等不同類型的貧血病人進行PNH三項檢查，同時對標(biāo)本采集、試劑貯備和實驗步驟進行簡化，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象為2010年3月至2012年9月113例贛州市人民醫(yī)院門診及住院的貧血和多系減少患者。男性48例，女性65例，中位年齡48.9(12～78)歲。觀察組各種疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合張之南的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]，其中經(jīng)CD55、CD59和FLAER檢查的PNH患者4例，確診AA 5～25個月的AA-PNH綜合征3例，經(jīng)鐵染色及血清鐵蛋白檢查的IDA患者20例、經(jīng)骨髓形態(tài)及血清葉酸和VitB12檢查的MA患者12例，經(jīng)骨髓形態(tài)和病理活檢檢查的MDS11例、經(jīng)Hb電泳或地中?；驒z查的地中海貧血患者2例、經(jīng)G6PD酶檢查的G6PD酶缺乏癥14例、經(jīng)Coombs試驗檢查的AIHA18例。其他病例10例，包括脾亢4例、慢性病貧血3例及不明原因溶貧、骨髓纖維化、骨轉(zhuǎn)移癌各1例，以及經(jīng)血尿常規(guī)及肝腎功能檢查均正常的非血液科患者的正常人對照20例，男女各10例。

1.2 試劑

1.2.1 0.2mmol/L鹽酸溶液4℃保存。

1.2.2 92.4g/L蔗糖溶液分裝(4.5ml/人份)，-20℃保存[3]。

1.2.3 Rous試驗試劑2g亞鐵氰化鉀加100ml蒸餾水溶解后，加入3ml濃鹽酸并加蒸餾水至200ml，充分混勻后立即分裝(4ml/人份)，-20℃保存[4]。

1.2.4 0.9%生理鹽水室溫保存。

1.3 儀器普通離心機和37℃水浴箱。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集靜脈血取患者靜脈血6ml，其中EDTA抗凝管1ml、3.8%枸櫞酸鈉抗凝至2ml、余血加至普通管分離血清用。同時送檢30ml新鮮尿液。

1.4.2 酸溶血試驗參照文獻[5]進行。操作步驟取EDTA血0.5ml用生理鹽水洗滌3次后配成配50%RBC懸液，然后按表1進行。加塞置37℃水浴1h后，1000r/min離心2min觀察結(jié)果。結(jié)果判斷陰性：A管與B管均不溶血或標(biāo)本本身溶血者則兩

管溶血程度一致；陽性：A管不溶血而B管溶血，或標(biāo)本本身溶血者則B管比A管溶血程度更嚴(yán)重。

表1 Ham試驗操作步驟(單位：ml)

1.4.3 蔗糖溶血試驗參照文獻[3]進行。首先將蔗糖溶液置37℃水浴箱中10min，然后按表2進行。加塞后輕輕顛倒混勻，A管37℃水浴0.5h后，1000r/ min離心2min觀察結(jié)果。結(jié)果判斷陰性：A管上清液無溶血現(xiàn)象；陽性：A管上清液有溶血現(xiàn)象而B管無或標(biāo)本本身溶血者則A管比B管上清液溶血程度更嚴(yán)重。

表2 蔗糖溶血試驗操作步驟(單位：ml)

1.4.4 尿Rous試驗將試劑置37℃水浴箱中5min，操作步驟及結(jié)果判斷參照文獻[3]進行。

2 結(jié)果

113例貧血患者中Ham陽性者7例(6.2%),蔗糖溶血試驗陽性者11例(9.7%),Rous試驗陽性者22例(19.5%)。PNH三項全部陽性者見于PNH和AA-PNH患者,對照組三項均為陰性。蔗糖溶血試驗陽性者在MDS、G6PD、AIHA和其他組溶血患者有檢出；尿Rous在MDS、G6PD和AIHA缺乏癥等亦有不同程度的檢出率。詳見表3。

3 討論

Ham試驗對PNH的診斷特異性強,敏感性為60%-86%,是臨床上確證PNH的主要依據(jù)[6],但僅憑這一項試驗確診PNH是不夠的，因為約有10%的PNH患者Ham試驗始終陰性[7]?！度珖R床檢驗操作規(guī)程》中的Ham試驗(6管法)操作強度大[8],存在以下幾方面不足：(1)標(biāo)本采集難：制備脫纖維血標(biāo)本容易引起標(biāo)本凝固或溶血。(2)找正常對照者難：要求與患者同血型或AB型正常對照者，導(dǎo)致試驗難于進行。(3)實驗步驟繁瑣，故在現(xiàn)今日常工作任務(wù)繁重的檢驗科嚴(yán)重受限。直接用EDTA抗凝血替代脫纖維血，用自身血清替代正常人血清，可大大簡化標(biāo)本采集過程并明顯提高實驗成功率。在113病例中有7例Ham試驗陽性者(其中1例PNH為弱陽性)，顯示了應(yīng)用自身血清的2管法Ham試驗對PNH及AA-PNH診斷有同樣的特異性，但操作步驟比6管法大大簡化，易在日常工作中進行。11例蔗糖溶血試驗陽性者中除PNH和AA-PNH外，在G6PD缺乏癥、MDS和AIHA病例中均有檢出，但陽性率均在10%以內(nèi)。Rous試驗的陽性率檢出率最高，為19.5%(22/113)。由此得出糖水溶血試驗和Rous試驗在貧血病人中敏感性更高而特異性不如Ham試驗。

表3 PNH三項檢查結(jié)果

PNH發(fā)病率不高，但因臨床表現(xiàn)多樣化，可單獨表現(xiàn)為貧血(1系減少)或多系減少，故臨床上PNH與AA、MDS及AIHA等疾病需彼此進行鑒別診斷。據(jù)文獻報道11.1%~28.6%的AA患者可演變?yōu)镻NH[9]，故有必要對AA患者進行定期PNH篩查。本組PNH患者分別有1月至7年的不明貧血原因的病史，亦側(cè)面反映臨床中PNH病人易誤診與漏診。目前，隨著流式細(xì)胞儀應(yīng)用，檢測糖基磷脂酰肌醇(GPI)缺陷細(xì)胞已成為診斷PNH最特異、最敏感且可以定量的最佳方法[1，9]，但昂貴的檢測費用使流式檢查難以廣泛應(yīng)用。近年來發(fā)現(xiàn)GPI缺陷細(xì)胞不僅見于PNH病人，許多貧血性疾病都有不同程度的檢出[9],故有必要結(jié)合傳統(tǒng)檢查項目來相互印證。Ham試驗、蔗糖水溶血試驗及Rous

試驗三項中連續(xù)兩次陽性，排除AIHA即可確診PNH[10]，因此傳統(tǒng)項目在臨床上仍有重要的地位。但傳統(tǒng)方法步驟繁瑣，加上病例不多，目前在二級以下醫(yī)院開展亦不普及，筆者在前人的工作基礎(chǔ)上，結(jié)合自身的工作經(jīng)驗，從標(biāo)本采集到試劑準(zhǔn)備(將Rous試驗和蔗糖溶血試劑配制后-20℃保存，使用前解凍，至少穩(wěn)定6個月)進行簡化，使PNH三項操作更加簡便實用，三項聯(lián)合可大大提高PNH的檢出率，減少漏診與誤診，加上費用低廉，臨床上樂意接受，故值得基層實驗室推廣。

[1]付蓉.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥現(xiàn)代診斷與治療[J].中國實用內(nèi)科雜志,2012,32(5):327-330.

[2]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第3版.北京：科學(xué)出版社,2008:192-195.

[3]李世榮,孫明強,趙強.血液學(xué)檢驗分冊[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2007:283-314.

[4]周建中.快速鐵染色法的有效性研究[J].實用臨床醫(yī)學(xué),2006,9:20.

[5]李淑蘭,周守琴,江滔,等.改良簡化的酸化血清溶血試驗及應(yīng)用[J].中國實驗診斷學(xué),2004,8(3):295-296.

[6]姜麗波,張波英,韓樹林,等.CD59檢測在PNH診斷中的應(yīng)用[J].中國中醫(yī)藥訊,2010,2(8):194.

[7]趙玉平,邵宗鴻.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥實驗室診斷[J].檢驗醫(yī)學(xué),2005,20(1):84-85.

[8]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程[J].第3版,南京:東南大學(xué)出版社.2006：191-192.

[9]喬偉振,李小雯,謝平,等.粒細(xì)胞CD59分子缺失表達(dá)在PNH特異性診斷指標(biāo)的價值分析[J].重慶醫(yī)學(xué),2011,7(40):1991-1994.

[10]王艷,左雅蓓,王玉昭,等.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥的診治[J].河北醫(yī)藥,2012,34(3):430-432.

R556.6+4

A

1674-1129(2013)01-0069-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.025