楊玉潔，張緒署，蘇麗君，鄒海蛟，鄒林峰，林雪遲

(長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，湖南長(zhǎng)沙410219)

應(yīng)用Pre-S1 Ag診斷HBV感染的可行性研究

楊玉潔，張緒署，蘇麗君，鄒海蛟，鄒林峰，林雪遲

(長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，湖南長(zhǎng)沙410219)

目的通過(guò)HBV Pre-S1抗原檢測(cè)，結(jié)合乙肝HBsAg、HBeAg與HBV-DNA檢測(cè)進(jìn)行比較分析，研究Pre-S1抗原作為診斷乙肝患者的血清標(biāo)志物的可能性。方法用ELISA檢測(cè)的HBsAg、HBeAg和HBV Pre-S1抗原，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)HBV核酸。結(jié)果相對(duì)于其他模式，“大三陽(yáng)”的HBV Pre-S1抗原的檢出率較高(89.32%)，乙肝病毒DNA的copies也較高；在90例在HBsAg(-)、HBeAg(-)患者中，檢出3例HBV Pre-S1抗原(3.33%)；恢復(fù)期的3091例患者中也檢查出4例Pre-S1 Ag(＋)。結(jié)論HBV Pre-S1抗原可作為一種HBV感染血清標(biāo)志物，HBsAg(－)并不能作為無(wú)HBV感染的指標(biāo)，Pre-S1檢測(cè)對(duì)于乙肝患者的診斷具有重大的價(jià)值。

HBV;Pre-S1抗原;HBV-DNA;熒光定量PCR;ELISA

傳統(tǒng)上對(duì)乙肝患者診斷采用“兩對(duì)半”檢測(cè)，是發(fā)現(xiàn)乙肝患者和感染狀況及抗體攜帶情況的主要指標(biāo)，包括乙肝表面抗原(HBsAg)、表面抗體(抗-HBs)，e抗原(HBeAg)，e抗體(抗-HBe)和核心抗體(抗-HBc)。不同的組合模式代表不同臨床表現(xiàn)，可以確定現(xiàn)癥感染與既往感染及是否具有免疫力等。

熒光定量PCR(FQ-PCR)也稱熒光實(shí)時(shí)PCR (Real-Time PCR)，F(xiàn)Q-PCR法檢測(cè)HBV-DNA，是直接檢測(cè)的HBV病毒自身，能更準(zhǔn)確的反映乙肝病毒在體內(nèi)復(fù)制和宿主的傳染性情況，是乙肝血清標(biāo)志物檢測(cè)必要補(bǔ)充，用于HBV定性與定量分析，反應(yīng)的是病毒的載荷。熒光PCR反應(yīng)同樣存在很多影響因素，包括引物、反應(yīng)體系、血清抑制物、標(biāo)本穩(wěn)定性等，對(duì)病毒的滴度也有一定的要求存在明顯的局限性[1]。

HBV前表面抗原有S區(qū)基因編碼，主要分Pre-S1與Pre-S2兩類。Pre-S1抗原出現(xiàn)在急性乙型肝炎感染的最早期和乙肝的活動(dòng)期，Pre-S1抗原主要用于HBV對(duì)肝細(xì)胞選擇性、親和性結(jié)合，是病毒傳播、復(fù)制與增殖的前提條件，Pre-S1抗原表達(dá)水平與病毒侵襲力正相關(guān)。Pre-S2抗原，目前未在我醫(yī)院臨床上進(jìn)行廣泛開(kāi)展。Pre-S1抗原性強(qiáng)，是臨床上判斷病毒是否處于高傳染性的活動(dòng)期的有力依據(jù)，與HBs Ag、HBeAg及HBV-DNA檢測(cè)關(guān)聯(lián)緊密，其獨(dú)特檢測(cè)價(jià)值有待進(jìn)一步探索[2]。

本研究選擇近五年到湖南省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行乙肝病毒檢查的體檢人群，通過(guò)陽(yáng)性乙肝患者的“兩對(duì)半”與HBV-DNA熒光檢測(cè)結(jié)果分析結(jié)合Pre-S1檢測(cè)，探討HBV Pre-S1抗原作為一種HBV感染患者的常規(guī)血清標(biāo)志物的可能性及其潛在臨床

價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器檢測(cè)乙肝五項(xiàng)ELISA試劑盒(北京萬(wàn)泰公司)，Pre-S1檢測(cè)試劑(上海阿爾法生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)Q-PCR試劑(上海復(fù)星生物公司)。熒光定量PCR儀(Light Cycler Roche，Switzerland)，酶標(biāo)儀2S-2型(DEM-III，北京)。

1.2 檢測(cè)對(duì)象近五年到湖南省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行乙肝病毒體檢的人群，有普通健康體檢的人員與單位健康體檢的人員，共7500例。其中男3652例，女3848例，年齡18～38歲。

1.3 標(biāo)本的采集清晨空腹采集其靜脈血5ml于真空采血管中，分離血清，離心(3500r/min,5min)，排除脂血等不合格血標(biāo)本。

1.4 主要方法

1.4.1 乙肝五項(xiàng)ELISA檢測(cè)按相關(guān)試劑盒說(shuō)明，正常血清為陰性，設(shè)置對(duì)應(yīng)酶標(biāo)值為0。FQ-PCR檢測(cè)HBV-DNA采用探針?lè)ǎ看卧O(shè)立4個(gè)HBVDNA標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度，1～4分別為5×107/ml、5×106/ ml、5×105/ml、5×104/ml。循環(huán)參數(shù)設(shè)定為50℃2min；93℃2min；93℃3s；60℃32s；35℃10s，43個(gè)循環(huán)；根據(jù)儀器的軟件進(jìn)行分析，得到各標(biāo)本的HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果(基線選取6～10或6～15個(gè)循環(huán)，閾值線選在陰性對(duì)照正常擴(kuò)增曲線的上方；測(cè)定值判斷標(biāo)準(zhǔn)為＞1×103Copies/ml為陽(yáng)性，＜1×103Copies/ml為陰性。

1.4.2 各種檢測(cè)模式編號(hào)為表面抗原(HBsAg,1)、表面抗體(HBsAb,2)、e抗原(HBeAg,3)、e抗體(HBeAb, 4)、核心抗體(HBcAb,5)五種血清標(biāo)志物。文中所用到的模式組合有1、3、5，1、4、5，1、5和2、4、5四種模式。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析用SPSS10.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 7500份標(biāo)本HBsAg、HBeAg及HBV-DNA(+)的檢測(cè)HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV-DNA(+)三項(xiàng)陽(yáng)性，共1668例。其中，HBsAg(+)1127例，檢出率為15.03%(1127/7500)，比例最高，提示絕大部分患者沒(méi)有免疫力；HBeAg(+)259例，檢出率為3.45% (259/7500)，HBV-DNA(+)282例，檢出率為3.76%，部分患者處于病毒復(fù)制與增殖的活動(dòng)期，感染性強(qiáng)。具體見(jiàn)表1。

2.2 Pre-S1抗原與HBsAg、HBeAg檢測(cè)分析在Pre-S1(＋)192例標(biāo)之中，乙肝五項(xiàng)主要分布于4種模式與Pre-S1抗原檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 7500例標(biāo)本HBsAg(＋)、HBeAg(＋)及HBV-DNA(+)的檢出率

表2 Pre-S1Ag(＋)在乙肝篩查4種分布模式中的檢出率

2.3 3350例HBV檢測(cè)一項(xiàng)或多項(xiàng)陽(yáng)性標(biāo)本的14種模式分布及構(gòu)成在乙肝五項(xiàng)檢測(cè)中，其中五項(xiàng)全部為陰性的標(biāo)本有4150例，有一項(xiàng)或多項(xiàng)陽(yáng)性的共計(jì)3350例(包含各種抗體陽(yáng)性的標(biāo)本），其中男性共有1624例，女性共有1726，所具有的模式有14種，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 Pre-S1抗原和HBV-DNA的檢測(cè)對(duì)全部表面抗原陽(yáng)性的標(biāo)本和部分恢復(fù)期模式組的標(biāo)本進(jìn)行Pre-S1抗原檢測(cè)和HBV-DNA檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4?！按笕?yáng)”1、3、5模式共103例，Pre-S1(+)有92例，HBV-DNA均值為1.568E+09 IU/ml，是高拷貝數(shù)；“小三陽(yáng)”1、4、5模式共81例，Pre-S1(+)有59例，HBV-DNA均值為1.267E+05 IU/ml；恢復(fù)期2、4、5，2、3、4、5，3、5模式Pre-S1(+)分別為2例、1例與1例，HBV-DNA為1.021E+03 IU/ml，拷貝數(shù)低。

2.5 Pre-S1 Ag(+)與HBV-DNA拷貝數(shù)相關(guān)性檢測(cè)前8標(biāo)本為“大三陽(yáng)”1、3、5、模式；9～16號(hào)標(biāo)本為，“小三陽(yáng)”1、4、5、模式，17～24號(hào)為HBsAg(+)標(biāo)本。可見(jiàn)表5。

3 討論

HBsAg(＋)、HBeAg(＋)及HBV-DNA(+)的檢測(cè)中，HBsAg(＋)檢出率最高，提示HBsAg檢測(cè)最敏感；Pre-S1Ag(＋)在乙肝篩查4種分布模式中的檢出率“大三陽(yáng)”高于“小三陽(yáng)”，Pre-S1檢出率與HBV感染進(jìn)程密切相關(guān)。另外，在HBsAg(-)、HBeAb(-)、HBcAb(-)模式中也檢測(cè)到3例，說(shuō)明HBsAg存在一定漏檢；3350份HBV檢測(cè)一項(xiàng)或多項(xiàng)陽(yáng)性標(biāo)本的14種模式分布及構(gòu)成比表明恢復(fù)

期模式2檢出率最高，與絕大部分體檢人群有過(guò)接種史是吻合的。本次檢測(cè)的90份HBsAg(-)與HBV-DNA低拷貝數(shù)的標(biāo)本中，有4份標(biāo)本Pre-S1抗原陽(yáng)性，證明HBsAg與HBV-DNA都有一定的漏檢；這也可能與Pre-S1抗原可出現(xiàn)在急性乙肝感染的最早期，Pre-S1抗原性強(qiáng)的特點(diǎn)，或者乙肝病毒表面抗原具有高度變異性，逃避了常規(guī)乙肝病毒血清標(biāo)志物方法的檢測(cè)，相關(guān)機(jī)制有待于更深入的對(duì)其研究[3，5]。

表3 3350份HBV檢測(cè)一項(xiàng)或多項(xiàng)陽(yáng)性標(biāo)本的14種模式分布及構(gòu)成比

表4 感染期和恢復(fù)期Pre-S1和HBV-DNA的檢測(cè)

另外，在HBsAg(－)樣本血清中也檢出了HBV-DNA與Pre-S1抗原，再次證實(shí)出現(xiàn)HBsAg (-)并不能作為無(wú)HBV感染的指標(biāo)，存在一定程度漏檢，可能與檢測(cè)條件有關(guān)。龔倩在血清樣本使用不同離心時(shí)間與轉(zhuǎn)速條件下也發(fā)現(xiàn)HBsAg檢出率會(huì)有差異[6]。

大部分樣本Pre-S1 Ag表達(dá)與HBV-DNA拷貝數(shù)正相關(guān)，但Pre-S1 Ag表達(dá)與HBV-DNA拷貝數(shù)并不完全同步，甚至出現(xiàn)低HBV-DNA拷貝數(shù)，而Pre-S1 Ag高表達(dá)。這一方面可能與HBV生物學(xué)特性有關(guān)，也有可能與HBV顆粒收集過(guò)程中丟失有關(guān)[7]。

本次Pre-S1Ag(＋)檢測(cè)結(jié)果中，“小三陽(yáng)”P(pán)re-S1抗原陽(yáng)性檢出率為72.84%(59/81)，這高于其他研究人員的報(bào)道，可能與筆者選擇的人群是健康體檢的群體有關(guān)[8-10]。

筆者的研究表明：“大、小三陽(yáng)”標(biāo)本與Pre-S1 Ag檢測(cè)之間有較高的符合率，但HBsAg檢出率高于Pre-S1 Ag，Pre-S1 Ag表達(dá)與HBsAg、HBVDNA檢測(cè)結(jié)果并沒(méi)有完全正相關(guān)聯(lián)性，但HBsAg與HBV-DNA都存在一定程度的漏檢，Pre-S1 Ag、HBsAg與HBV-DNA三者間可以相互之補(bǔ)充。HBV Pre-S1抗原可以作為一種HBV感染患者檢測(cè)的常規(guī)血清標(biāo)志物，對(duì)于乙肝患者的診斷具有重大的價(jià)值。

[1]錢(qián)東林.乙肝HBV-DNA熒光定量檢測(cè)與血清標(biāo)志物結(jié)果相關(guān)性[J].臨床合理用藥,2009,2(24)：13-14.

[2]Yeung P,Wong DK,Lai CL,et al.Association of hepatitis B virus pre-S deletions with the development of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B[J].J Infect Dis，2011，203(5):646-54.

[3]Sonneveld MJ,Zoutendijk R,Janssen HL.Hepatitis B surface antigen monitoring and management of chronic hepatitis B[J].J Viral Hepat,2011,18(7):449-57.

[4]駱抗先,閔佳,何海榮,等.單一抗-HBc陽(yáng)性個(gè)體的血清傳染性和隨訪[J].肝臟病學(xué)雜志,2004,32(1):5-7.

[5]丁靜娟,王梅,劉悅暉.乙型肝炎病毒前S基因變異與肝病進(jìn)展的關(guān)系[J].中華傳染病雜志,2007,25(06):332-337.

[6]龔倩.不同離心條件對(duì)HBsAg檢測(cè)結(jié)果的影響[J].免疫學(xué)雜志, 2011,27(12):1071-1073.

[7]曾興光,石統(tǒng)東,韓俊峰,等.HBV顆粒的純化及生物學(xué)活性鑒定[J].免疫學(xué)雜志,2010,26(4):340-343.

[8]龍紹芬,黎鐵斌.乙肝兩對(duì)半定量檢測(cè)結(jié)果分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(2):187-188.

[9]Sanchez LV,Maldonado M,Bastidas-Ramirez BE,et al.Genotypes and S-gene variability of Mexican hepatitis B virus strains[J].J Med Virol,2002，68(6):24-32.

[10]梁紅,胡同平,張文蘭.乙型肝炎表面抗原陰性、核心抗體陽(yáng)性樣本的臨床意義[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011,38(15):3048-3049.

Correlation analysis between HBV Pre-S1 assaying and clinical diagnosis on hepatitis B patients

YANG Yujie,ZHANG Xushu,SU Lijun,et al.Department of Clinical Microbiology and Immunology,Changsha Medical University,Changsha 410219, China

ObjectTo explore the relationship between the detection of Pre-S1 antigen and the diagnosis of hepatitis B patients.Methods ELISA was used to detect the hepatitis B virus sAg,eAg and Pre-S1 antigen.Meanwhile,Fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)was applied for HBV-DNA detection.Results Compared with other models,the model of HBsAg(+),HBeAg (+)and HBcAb(+)has the highest positive percentage of HBV Pre-S1 antigen(89.32%),which has higher hepatitis B virus DNA copies,there is a positive correlation between hepatitis B virus DNA copies and the Pre-S1 antigen.Conclusion Pre-S1 antigen of hepatitis B virus can be used as a serum marker to detect hepatitis B virus infection,HBsAg(-)is not the only feature to judge whether patients infected by HBV or not，the Pre-S1 detection has great value in diagnosing the hepatitis B patients.

HBV；Pre-S1 Ag；HBV-DNA；FQ-PCR；ELISA

表5 Pre-S1檢測(cè)結(jié)果的吸光度值和HBV-DNA拷貝數(shù)

R446.62，R512.6+2

A

1674-1129(2013)02-0015-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.006

長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目資助（NO:201226）

楊玉潔，女，1989生，漢族，學(xué)士，長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系。

林雪遲，男，1971生，湖南安鄉(xiāng)人，博士，副教授，長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室主任。