張佳娜，汪慶余，曾磊，陳青，陳婧，李慶，雷浪，王莉，郝華，蘇曉燕，馮瓊，劉繁榮，李里香，張文昌，徐高四，鄔黎青

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，江西南昌330006;2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)中心，江西南昌330006；3、南昌大學(xué)護理學(xué)院，江西南昌330006;4、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江西南昌330006)

·論著·

乳腺癌細(xì)胞中p73ɑ與ERɑ的相互關(guān)系

張佳娜1，2，汪慶余1，曾磊1，陳青1，2，陳婧3，李慶1，雷浪1，王莉1，2，郝華1，蘇曉燕1，馮瓊1，劉繁榮1，李里香1，張文昌1，徐高四4，鄔黎青1，2

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，江西南昌330006;2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)中心，江西南昌330006；3、南昌大學(xué)護理學(xué)院，江西南昌330006;4、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江西南昌330006)

目的探討乳腺癌細(xì)胞中ERɑ蛋白與p73ɑ蛋白之間物理上及功能上的相互關(guān)系。方法采用蛋白印跡法檢測ERɑ與p73ɑ的蛋白表達；用免疫共沉淀法檢測ERɑ蛋白與p73ɑ蛋白之間的相互結(jié)合；用熒光素酶分析實驗進一步檢測ERɑ與p73ɑ基因的轉(zhuǎn)錄活性，以探討ERɑ與p73ɑ蛋白表達改變的原因。結(jié)果(1)經(jīng)蛋白酶抑制劑MG132處理細(xì)胞后，ERɑ蛋白及p73ɑ蛋白能結(jié)合成復(fù)合體。(2)共轉(zhuǎn)染ERɑ與p73ɑ時，ERɑ及p73ɑ能相互抑制彼此蛋白表達。結(jié)論乳腺癌細(xì)胞中ERɑ及p73ɑ能結(jié)合形成復(fù)合體并能相互抑制彼此蛋白的表達。

乳腺癌；ERɑ；p73ɑ；相互結(jié)合

流行病學(xué)資料顯示，乳腺癌在中國是最常見的惡性腫瘤之一，占所有腫瘤的7%～9%，而且其發(fā)病率在逐年增加[1]。大量文獻提示雌激素刺激乳腺上皮細(xì)胞在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展中起主要作用。雌激素通過多種不同的機制引起細(xì)胞改變。其中主要機制是結(jié)合核蛋白雌激素受體(ER)[2]。本研究中，我們檢測ERα是否會與p73α物理性地結(jié)合以及在蛋白水平表達上這兩個基因是相互促進還是相互抑制。通過免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)ERα與p73α能結(jié)合形成復(fù)合體。并發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染ERα及p73α能檢測出的ERα及p73α的蛋白量均明顯減少。結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料MCF-7細(xì)胞株購買于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；P73α質(zhì)粒及PCDNA3.0載體由Maki博士(美國芝加哥大學(xué))惠贈；ERα質(zhì)粒由Nardulli博士(美國伊利若依斯大學(xué))惠贈；常規(guī)分子生物學(xué)試劑購于天根生化(北京)科技有限公司；多克隆的ERα抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，p73α單抗購自美國Abcom，β-actin單抗購自中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及DNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞株是含有野生型ERα乳腺癌細(xì)胞株，它還攜帶p73α基因，表達少量的p73α蛋白。MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37oC培養(yǎng)。當(dāng)MCF-7細(xì)胞長到60%的密度時，按照操作手冊，利用轉(zhuǎn)染劑Lipofectemin(invitrogen，Inc)把ERα及p73α同時轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。通過增加空質(zhì)粒，使每個轉(zhuǎn)染中的DNA總量達到相等。為了減少蛋白酶對細(xì)胞內(nèi)ERα及p73α的降解，蛋白酶抑制劑MG132(invitrogen，Inc)被用來處理細(xì)胞6h。

1.3 免疫共沉淀及免疫印跡常規(guī)培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，以2ml PBS洗細(xì)胞2次，刮入500μl的裂解液中并轉(zhuǎn)入離心管中。細(xì)胞在冰上孵育30 min，之后

在4℃離心機中14000r/min離心15min以去除細(xì)胞殘渣。免疫共沉淀時，260μg的轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞提取液中加入200ng的多克隆的ERα抗體沉淀細(xì)胞裂解液中的ERα抗原。ERα的免疫沉淀物被分離并結(jié)合在瓊脂蛋白A珠子上。為了做免疫印跡，蛋白裂解液或ERα的免疫沉淀物在SDS-PAGE中分離并被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進行免疫印跡。使用的抗體包括p73α單抗及β-actin單抗。

2 結(jié)果

2.1 ERα與p73α能結(jié)合形成復(fù)合體ERα及p73α都是可被蛋白酶降解的壽命很短的蛋白，內(nèi)源性ERα及p73α蛋白很快被降解，并且ERα比p73α蛋白的壽命更短(maki30-32圖1，列1及列3)。轉(zhuǎn)染外源性ERα及p73α提高蛋白的表達量，經(jīng)蛋白酶抑制劑MG132處理后，二者蛋白的降解減少，其濃度在細(xì)胞內(nèi)明顯增高(圖1)。用抗ERα的多克隆抗體結(jié)合MCF-7細(xì)胞蛋白裂解液中的ERα抗原并用蛋白A瓊脂珠子將抗原抗體復(fù)合物沉淀下來。脫開蛋白A瓊脂珠子后，用SDS-PAGE將ERα分離出來并進行免疫印跡。結(jié)果表明ERa抗原與蛋白A瓊脂珠子是充分結(jié)合的(圖1，列2及列4)。我們進一步想知道想知道ERα與p73α之間是否有結(jié)合，故用抗p73α單克隆抗體標(biāo)示ERα存在的PVDF膜。結(jié)果顯示ERα與p73α形成了復(fù)合體，二者有結(jié)合(圖1)。圖1中列1、2及列3中的細(xì)小條帶是內(nèi)源性結(jié)合的結(jié)果。

圖1 ERα與p73α能結(jié)合形成復(fù)合體

MCF-7細(xì)胞分成四組，1：PCDNA3.0 6μg，2：PCDNA3.04μg+Flag-ERα2μg，3：PCDNA3.0 2μg+Flag-P73α 4μg，4：Flag-ERα2μg+Flag-P73α 4μg的方案轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后18h第四組加入MG132(20μM)作用6h，轉(zhuǎn)染24h后進行細(xì)胞總蛋白提取，用抗ERα的多克隆抗體結(jié)合總蛋白中的ERα抗原并用蛋白A瓊脂珠子將抗原抗體復(fù)合物沉淀下來。用沉淀下來的復(fù)合物進行SDS-PAGE電泳后用p73α的單克隆抗體進行免疫印跡分析。

2.2 ERα與p73α相互減少彼此的蛋白表達ERa與p73α能結(jié)合在一起形成復(fù)合體，但二者的功能相反，我們推測在蛋白表達上，二者是相互抑制的。為了檢測這一假設(shè)，我們將MCF-7細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染ERα質(zhì)?；騪73α質(zhì)粒及共轉(zhuǎn)染ERα質(zhì)粒和p73α質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后提取總蛋白，SDS-PAGE蛋白電泳后分別用ERα于p73α抗體標(biāo)記蛋白。結(jié)果表明共轉(zhuǎn)染ERα及p73α?xí)r，二者的蛋白檢出量明顯減少(圖2)。

圖2 ERa與p73a相互抑制蛋白表達

將MCF-7細(xì)胞分成四組，按照1：PCDNA3.0 6μg，2：PCDNA3.04μg+Flag-ERα2μg，3：PCDNA3.0 2μg+Flag-P73α 4μg，4：Flag-ERα 2μg+Flag-P73α 4μg的方案轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24h后進行細(xì)胞總蛋白提取，總蛋白SDS-PAGE電泳后用ERα和p73α的多克隆抗體進行蛋白印跡分析。

3 討論

雌激素受體(ER)是核受體家族成員，能調(diào)節(jié)雌激素的多種功能。ER有多種異形體。其中ERɑ由6個進化穩(wěn)定的功能區(qū)組成，最高度保真的是DNA結(jié)合功能區(qū)(DBD)。ERɑ與雌激素應(yīng)答基因上的雌激素應(yīng)答成分(ERE)的結(jié)合必須有DBD的存在。ERɑ另一高保真功能區(qū)是配體結(jié)合區(qū)(LBD)，它能引導(dǎo)ERɑ與激素之間的結(jié)合。一旦結(jié)合激素，ERa發(fā)生構(gòu)象變化，其DBD結(jié)合到雌激素應(yīng)答基因上的雌激素應(yīng)答成分(EREs)。ERɑ是雌激素激活的轉(zhuǎn)錄因子，EREs位于雌激素應(yīng)答靶基因的啟動子區(qū)域，通過直接結(jié)合到EREs或間接通過像AP1及Sp1這樣的DNA結(jié)合因子結(jié)合到EREs上，ERa被征集到靶基因的啟動子區(qū)，調(diào)控靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄而改變靶細(xì)胞中多種雌激素應(yīng)答基因的表達，從而調(diào)節(jié)各種組織的生長及發(fā)育，促進乳腺癌細(xì)胞的增生[3-5]。乳腺的癌前病變及癌腫中ERɑ的表達均增高[6]，在雌激素的作用下，這些病變中的細(xì)胞增生更快。

p73是p53家族成員。野生型p53是轉(zhuǎn)錄因

子，它能結(jié)合在多種靶基因的啟動子區(qū)域從而激活這些靶基因的轉(zhuǎn)錄。p53通過激活其信號傳導(dǎo)通路的某些下游靶基因，如Waf1/p21,引起細(xì)胞周期阻滯而抑制細(xì)胞生長[7]；通過激活Fas/Apo1,Noxa, Bax,PUMA及Apaf1基因等，引起細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤的生長[8,9]。癌腫引起的p53突變阻斷了p53序列特征性的DNA結(jié)合能力，導(dǎo)致這些生長抑制靶基因的表達降低。多數(shù)癌腫中，由于p53基因突變或p53調(diào)節(jié)因子的改變p53腫瘤抑制通路而失去抑制腫瘤的活性[10-12]。喪失功能的p53突變發(fā)生在50%以上甚至所有的人類癌腫中，p53缺如的小鼠發(fā)生多種腫瘤并在幼小時就死去[13,14]。乳腺癌中，p53的體突變率是21.37%，還存在一定比率的種系突變(www-p53.iarc.fr)。P73是p53相關(guān)蛋白，與p53共享高百分率的相同氨基酸序列，有多個同源異形體。其中P73α和p53能執(zhí)行某些相同功能。如：當(dāng)過度表達時，p73α能結(jié)合并激活多種p53靶基因而引起細(xì)胞生長阻滯或凋亡[15,16]。而且象p53一樣，當(dāng)細(xì)胞應(yīng)對某些壓力時，內(nèi)源性p73α增高。故在p53缺如的細(xì)胞中，p73α能引起細(xì)胞生長阻滯及調(diào)亡。腫瘤細(xì)胞很少發(fā)生p73α突變，Shishikura及Schwartz等在乳腺癌中未發(fā)現(xiàn)p73的突變[17,18]。在p53異常的乳腺癌中p73α的抑制癌腫的作用十分重要。ERα促進腫瘤生長，p73α抑制腫瘤生長，兩者功能相反。我們推測二者之間可能存在負(fù)向調(diào)節(jié)。ERα能結(jié)合p53并能抑制p53的功能已有報道[19]，但乳腺癌細(xì)胞中ERα與p73α的相互關(guān)系如何至今尚未有研究發(fā)表。

ERα能結(jié)合p53并抑制p53的功能已在體外轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中證實。Liu等的實驗表明ERα的含LBD及AF-2(activation function-2)功能區(qū)的AA285~AA395段參與p53的結(jié)合，而非ERα的DBD；而且表明ERα結(jié)合在p53的C末端的AA319~AA393。p73和p53的氨基酸序列相似，二者均含有N端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TAD)，脯氨酸富有區(qū)(PRD)，中央的DNA結(jié)合區(qū)(DBD)以及C端的寡聚化區(qū)(OD)，其中DBD的氨基酸相同率高達63% (21,22)。從基因的OD段開始，p53的C末端有86AA。p73α的C末端有285AA，有含p53的C末端的AA319~AA393序列的可能。我們的結(jié)果表明ERα與p73α有明顯的結(jié)合。除外源性結(jié)合外(圖1列4)，我們還檢測到了二者內(nèi)源性的結(jié)合(圖1列1及列3)。列2中見大量的ERα被沉淀下來，我們推測有相應(yīng)量結(jié)合其上的p73α蛋白應(yīng)被檢測到，但結(jié)果圖中幾乎見不到p73α?？赡艿脑蚴寝D(zhuǎn)染的p73α質(zhì)粒不足，p73α蛋白被ERα降解，或ERα抑制了p73α的轉(zhuǎn)錄活性等(圖2)?？梢姡橄侔┘?xì)胞中ERɑ及p73ɑ能結(jié)合形成復(fù)合體并能相互抑制彼此蛋白的表達。

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Co-relation between ERɑ and p73ɑ in breast cancer cells

Z HANG Jiana，WANG Qingyu，ZENG Lei，et al.Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo investigate the physical and functional relation between ERɑ and p73ɑ in breast cancer cells. Methods Protein expressions of ERɑ and p73ɑ were examined by Western Blot.The binding assay for ERɑ and p73ɑ was tested with Co-IP and immunoblot.Transcriptional activity of ERɑ and p73ɑ was analysed by Luciferase assay.Results and Conclusion (1)ERɑ and p73ɑ can bind to each other.(2)ERɑ and p73ɑ can be combined to form complex and mutually inhibit protein expression of each other in breast cancer cells.

Breast cancer；ERɑ；p73ɑ；Binding

R739.7

A

1674-1129(2013)01-0004-3

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.002

國家自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：30960430）；江西省自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：20114BAB205053）

張佳娜，女，1987年11月生，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)碩士研究生，研究方向為腫瘤分子生物學(xué)。

鄔黎青，病理學(xué)博士，病理科主任，研究生導(dǎo)師。