丁昭珩 趙其德 梁洪享 倪裕豐 劉合代 張 明 楊 英 丁 罡

Pim激酶家族是一組鈣/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)激酶(CAMP)，包括 3 個(gè)成員(Pim-1、Pim-2、Pim-3)，其中Pim-1可以參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。目前已證實(shí)，一些實(shí)體腫瘤如前列腺腫瘤等中Pim-1存在高表達(dá)［1］，國(guó)外的最新研究提示Pim-1激酶在肺癌內(nèi)也有表達(dá)。我們通過免疫組化的方法分析了70例肺癌組織中的Pim-1激酶的表達(dá)，探討Pim-1在肺癌的病程發(fā)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2008年1月～2011年12月我院胸外科手術(shù)切除的確診肺癌石蠟標(biāo)本共70例，其中男性54例，女性16例，年齡43～76歲。所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)并有完整的臨床資料，術(shù)前均未接受過任何化療和放療。腫瘤直徑≤3 cm 33例，腫瘤直徑＞3 cm 37例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。腺癌23例，鱗癌38例，小細(xì)胞肺癌5例，腺鱗癌3例，梭形細(xì)胞癌1例。根據(jù)UICC2009版的肺癌TNM分期進(jìn)行病例分期，Ⅰ期27例，Ⅱ期17例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例。隨機(jī)選取癌旁3 cm以外相對(duì)正常的肺組織20例作為對(duì)照組標(biāo)本。所有標(biāo)本均用10%福爾馬林液固定，并常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗Pim-1單克隆抗體購(gòu)于Abcam公司;三步法組化試劑盒、山羊抗兔IgG，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟，階梯乙醇脫水，3%過氧化氫孵育5～10 min，沖洗，PBS進(jìn)行熱修復(fù)，0.1MPBS按1∶10稀釋的羊血清封閉，37℃，20 min?？牡粞蜓?，加入1∶100稀釋的一抗，37℃，1 h，4℃過夜。各步以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。組化用0.01MPBS沖洗3次，每次3 min。加入二抗，37℃，30 min。用0.01MPBS 沖洗3 次，每次2 min。DAB顯色10 min，蒸餾水終止并充分沖洗。蘇木精復(fù)染，中性樹脂封固。

1.2.3 染色結(jié)果判斷 陰性表示無陽性細(xì)胞。弱陽性為陽性細(xì)胞質(zhì)染成均勻的淡黃色或胞質(zhì)呈棕色的細(xì)胞數(shù)≤50%。強(qiáng)陽性表示胞質(zhì)染成深棕色的細(xì)胞數(shù)＞51%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS14.0 for Windows統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。陽性率比較采用卡方檢驗(yàn)，組間Pim-1的表達(dá)強(qiáng)度的比較采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Pim-1表達(dá)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

光鏡下，Pim-1陽性染色為淡黃色、棕黃色、棕褐色，程度不等，廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)于核膜，呈彌漫分布。

2.2 Pim-1在肺癌組織及正常對(duì)照組中的表達(dá)情況

正常肺組織中Pim-1的陽性率是30.00%，肺癌組織中Pim-1的陽性率是61.43%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.5168，P=0.0388，＜0.05)。見表1。

表1 Pim-1在肺組織中的表達(dá)情況(例)

2.3 肺癌臨床病理指標(biāo)與Pim-1的表達(dá)

在肺癌患者中，Pim-1的表達(dá)與腫瘤直徑TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，與患者的性別、有無吸煙史、病理分型無明顯相關(guān)性。見表2。

表2 Pim-1的表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

近年的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，肺癌為我國(guó)癌癥發(fā)病率和死亡率上升最快的腫瘤［2］，發(fā)病率及死亡率均居腫瘤之首［3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年大約有130萬人死于肺癌［4］。目前肺癌總的5年生存率只有13% ～15%。

Pim激酶家族是一組鈣/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)激酶(CAMP) ，該家族各成員(Pim-1、Pim-2、Pim-3)在激酶結(jié)構(gòu)域高度同源，其生物學(xué)功能也存在顯著的重疊。Pim-1基因編碼1種絲/蘇氨酸激酶，最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入點(diǎn)而被發(fā)現(xiàn)的。Pim-1的表達(dá)非常廣泛，從血生成細(xì)胞系和淋巴細(xì)胞系到口腔上皮系。研究表明，Pim-1是多種關(guān)鍵生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分，而這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。Pim-1的過度表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，阻斷多種凋亡誘導(dǎo)通路，干擾細(xì)胞周期的正常調(diào)控，最終導(dǎo)致各種惡性腫瘤的形成。Bachmann等研究發(fā)現(xiàn)原癌基因Pim-1是細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的下游效應(yīng)因子，能夠通過改變幾種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的活性而加快細(xì)胞周期的進(jìn)程。Pim-1能夠直接磷酸化Cdc25C，推進(jìn)細(xì)胞周期G2/M的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化［5］。凋亡蛋白Bad的第112個(gè)絲氨酸是1個(gè)活性管家基因。Aho等［6］研究發(fā)現(xiàn)Pim-1激酶可使這個(gè)位點(diǎn)磷酸化從而使其活性喪失，保護(hù)細(xì)胞幸免于凋亡蛋白Bad的凋亡效應(yīng)。Kim等［7］曾用基因型和單倍體分析對(duì)Pim-1基因多態(tài)性及肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)間的相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Pim-1基因的T-C-T-C單倍體(1196 T＞C，IVS4+55 T＞C，IVS4+1416 T＞A和+3684 C＞A)可能影響韓國(guó)人口中發(fā)生吸煙相關(guān)性肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。在前列腺癌方面，He等［1］研究指出前列腺癌，前列腺增生組織和正常前列腺組織中的Pim-1 mRNA含量之間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。QRT-PCR檢測(cè)Pim-1 mRNA的表達(dá)量為前列腺癌的診斷提供了1個(gè)可靠的標(biāo)準(zhǔn)。田榮華等［8］采用免疫組化方法評(píng)估了53例初治原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的Pim-1表達(dá)，結(jié)果顯示，Pim-1蛋白高表達(dá)與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的負(fù)性預(yù)后相關(guān)。Pim-1蛋白高表達(dá)患者的3年總生存率和化療完全緩解率均較低表達(dá)者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中Pim-1的高表達(dá)可以作為臨床預(yù)后的不良標(biāo)志。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Pim-1蛋白在肺癌中表達(dá)高于正常肺組織，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［9，10］。肺癌組織 Pim-1的染色強(qiáng)度與腫瘤的TNM分期具有相關(guān)性，腫瘤分期越晚，Pim-1表達(dá)水平越高;瘤體較大的病例(＞3cm)比瘤體小者(直徑≤3 cm)Pim-1表達(dá)明顯增加，兩者具有明顯正相關(guān)性。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的病例也較陰性者Pim-1表達(dá)增加。結(jié)果提示Pim-1與腫瘤的疾病發(fā)展程度有關(guān)。

肺癌的發(fā)生是1個(gè)多階段、多基因、多因素參與的復(fù)雜過程，其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。Pim-1在肺癌中的潛在機(jī)制以及與肺癌進(jìn)展之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

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