李雪青，石志敏（．河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000；．唐山市中醫(yī)醫(yī)院，河北唐山063000）

·實驗研究·

繆刺對腦缺血大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達影響的研究

李雪青1，石志敏2
（1．河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000；2．唐山市中醫(yī)醫(yī)院，河北唐山063000）

目的：探討繆刺對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)保護作用的機制。方法：觀察以免疫組化法檢測繆刺對腦缺血模型大鼠腦缺血后24、48、72h 3個時間點大腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果：繆刺對腦缺血模型大鼠大腦皮質(zhì)C.53蛋白表達有抑制作用，對HSP70、PKB蛋白表達有促進作用。結(jié)論：繆刺對大鼠局灶性腦缺血具有保護作用，可能與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。

繆刺；腦缺血；細(xì)胞凋亡；神經(jīng)保護；大鼠

本研究通過觀察繆刺對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響，進一步闡明繆刺對腦缺血的神經(jīng)保護作用，同時也為繆刺的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組 雄性Wistar大鼠80只，隨機分成模型對照組、普通針刺組、繆刺組、普通針刺和繆刺同時組，每組20只大鼠。

1.2 針刺選穴與操作 模型對照組：不予治療，每天同樣抓取1次，不做其他處理。普通針刺組：根據(jù)華興邦等研制的大鼠穴位圖譜選取穴位：合谷、內(nèi)關(guān)、委中、三陰交。針具：30號1寸毫針（華佗牌，蘇州針灸器械廠）。操作方法：先在施針處常規(guī)消毒，然后持針依次在大鼠左側(cè)肢體上（患側(cè)）針刺以上4穴，為保證刺激強度的穩(wěn)定，采用電針方法，直刺進針5mm，針柄連接于電針治療儀電極上，頻率2Hz，電壓一般3.5V，電流1～2mA，疏密波，1次/d，30min/次。繆刺組操作同上，選穴在大鼠右側(cè)肢體（健側(cè)）。普通針刺和繆刺同時組：操作同上，雙側(cè)肢體同時選穴（健側(cè)、患側(cè)同時）。首次針刺造模術(shù)后6h開始，治療各組療程分別為1、3、5、10、15d，每日1次。

1.3 右側(cè)大腦中動脈阻塞模型制作 采用改良的Longa和Nagasawa方法［1］：將Wistar大鼠制備為MCAO模型，操作方法：1）單股尼龍線，直徑為0.231mm，長1.97cm，制成線栓，消毒后備用。2）用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。3）頸部切口，逐層分離并暴露右側(cè)頸總動脈，小心分離頸外動脈。4）在已分離的CCA上結(jié)扎其近心端，遠心端阻斷血流、合線。5）剪一“V”形切口。6）將線栓球面端插入CCA上的切口，將線栓經(jīng)CCA插入IcA內(nèi)，向前徐進，向上插至McA起始部，此時自ECA、ICA分叉處計起，線栓推進長度約為（17.9±l）mm，造成MCA血供阻斷。各組選取MCAO術(shù)后評分合格大鼠8只，進行實驗操作。

1.4 繆刺對MCAO模型大鼠腦組織HSp70、PKB蛋白表達的影響 操作：1）載玻片防脫片劑處理。2）腦組織固定、脫水、透明、包埋及切片。3）將切片置于經(jīng)防脫片劑處理過的載玻片上，保存，備用。4）石蠟切片脫蠟水化→顯色劑DAB顯色→顯微鏡觀察。5）終止反應(yīng)→復(fù)染→沖洗返藍→脫水→封片觀察。6）結(jié)果：胞核或胞漿棕黃色為陽性細(xì)胞。7）圖像分析：400倍光鏡下，計數(shù)陽性細(xì)胞，觀察5個高倍視野，計數(shù)每100個細(xì)胞中染色的細(xì)胞數(shù)。8）取其平均值，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 繆刺對MCAO模型大鼠大腦皮質(zhì)熱休克蛋白70（HSP70）蛋白表達的影響 見表1。

表1 繆刺對MCAO模型大鼠大腦皮質(zhì)HSP70蛋白表達的影響（±s，n＝8）

表1 繆刺對MCAO模型大鼠大腦皮質(zhì)HSP70蛋白表達的影響（±s，n＝8）

注：與對照組比較，＃P＜0.05。

組別陽性細(xì)胞表達平均數(shù)24 h 48 h 72 h模型對照組25.98±7.01 23.87±5.46 22.43±5.96普通針刺組35.03±9.16＃30.43±4.89＃30.11±7.89?？姶探M 36.55±10.76＃28.47±8.35＃27.28±6.74＃普繆組 38.94±10.77＃34.07±9.13＃32.54±9.63＃

2.2 繆刺對MCAO模型大鼠大腦皮質(zhì)蛋白激酶B（PKB）蛋白表達的影響 見表2。

表2 繆刺對MCAO模型大鼠大腦皮質(zhì)PKB蛋白表達的影響（±s，n＝8）

表2 繆刺對MCAO模型大鼠大腦皮質(zhì)PKB蛋白表達的影響（±s，n＝8）

注：與模型對照組比較，＃P＜0.05。

組別陽性細(xì)胞表達平均數(shù)24 h 48 h 72 h模型對照組23.59±7.31 26.41±7.76 25.97±10.29普通針刺組32.75±7.43＃37.20±11.48＃37.95±9.42?？姶探M 30.37±12.36＃35.21±9.67＃35.01±12.14＃普繆組 34.73±13.38＃37.89±12.57＃40.23±12.29＃

3 結(jié)論

細(xì)胞凋亡是在基因控制下的細(xì)胞主動死亡，［2－3］其異常與多種疾病密切相關(guān)，如腫瘤、免疫疾病等。［4］從生物全息律醫(yī)學(xué)角度來看，人體整體與局部，局部與局部之間存在著全息對應(yīng)。［5］繆刺作為一種針刺方法最早出現(xiàn)于《內(nèi)經(jīng)》中，是一種左病治右，右病治左針刺方法?？姶逃惺諗z浮散之正氣，開通痞結(jié)氣機的作用［6］。

［1］徐凌．PKB/Akt及其生理作用的研究進展［J］．國外醫(yī)學(xué)（流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊），2003，30（4）：233－236．

［2］白雪．晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的實驗研究進展［J］．長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，22（4）：83－84．

［3］馬少丹，阮時寶，苑述剛．久瀉寧顆粒對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎細(xì)胞凋亡及其調(diào)控蛋白影響的研究［J］．長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，27（6）：909－910．

［4］楊旭東，張杰，劉洪鳳，等．誘導(dǎo)人胃癌BGC－823細(xì)胞凋亡作用及其機制研究［J］．長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，26（4）：572－573．

［5］王玉明，巨繆刺加艾灸治療肢體慢性疼痛198例［J］．吉林中醫(yī)藥，2010，30（6）：513－514．

［6］劉雅靜，張伯儒，繆刺結(jié)合刺絡(luò)拔罐法治療頑固性面神經(jīng)麻痹臨床研究［J］．吉林中醫(yī)藥，2008，28（1）：46－47．

R246

A

1007－4813（2013）02－0193－02

2012－12－20）

唐山市科技計劃項目支持項目（編號：12140209A－57）。

李雪青（1978－），女，講師。研究方向：中醫(yī)學(xué)。